金黃色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z結(jié)構(gòu)域串聯(lián)體的克隆、表達(dá)和篩選

萬一，訾靜，張琨，張志敏，張?jiān)戮辏蹒?，王?/p>

陜西省微生物研究所 分子生物學(xué)研究中心，陜西 西安 710043

金黃色葡萄球菌蛋白 A (Staphylococcus aureusprotein A，SpA) 是一種金黃色葡萄球菌胞壁蛋白。天然SpA含有5個(gè)高度同源的結(jié)構(gòu)域，分別命名為 E、D、A、B、C (圖 1)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都能夠與人及多種哺乳動(dòng)物如豬、狗、兔、猴、鼠、小鼠及牛等免疫球蛋白G (IgG) 分子中的Fc區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合不會(huì)影響IgG抗體Fab片段與抗原特異性結(jié)合的能力[1-3]。將這 5個(gè)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成的重組SpA與瓊脂糖凝膠偶聯(lián)，可制備用于抗體純化的親和填料[4-6]，但由于不同的域結(jié)合強(qiáng)度略有差異，導(dǎo)致洗脫條件不均一，經(jīng)常需要在較低的pH及高濃度的變性劑等相對(duì)劇烈的條件下對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行洗脫，一些抗體經(jīng)受不了這樣苛刻的洗脫條件而失活[1,7-8]。因此，運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)SpA基因進(jìn)行改造，采取同型結(jié)構(gòu)域串聯(lián)，可以使其具有更好的特異性，能夠避免不同結(jié)構(gòu)域與抗體 Fc段親和性的差異，使洗脫條件溫和而均一[9-10]。

Z結(jié)構(gòu)域是在與IgG結(jié)合力較好的B結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，將 Gly定向誘變成為 Ala(圖 1)[11-12]。Z結(jié)構(gòu)域提高了B結(jié)構(gòu)域?qū)NBr和羥胺的耐受性以及與IgG結(jié)合的能力，并降低SpA與Fab片段的相互作用，可作為捕獲IgG的固定化親和配體[10,13-16]。有研究表明，將 Z結(jié)構(gòu)域頭尾相連形成的雙 Z結(jié)構(gòu)域具有較高的穩(wěn)定性，并且使親和層析中的洗脫條件也更加緩和[17]。因此對(duì)Z結(jié)構(gòu)域的研究已成為目前抗體親和介質(zhì)研究的熱點(diǎn)。

圖1 天然SpA結(jié)構(gòu)以及B結(jié)構(gòu)域定點(diǎn)突變[4,11]Fig. 1 Natural SpA structure and B domain site-directed mutation[4,11]. The SpA shown here is a cell-wall associated protein, consisting of a signal sequence (S) processed during secretion, five homologous IgG-binding domains (E, D,A–C), and a cell-wall attaching structure (XM). Also shown is the Z domain, corresponding to an engineered version of the B domain of SpA.

雖然國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于 SpA-Z結(jié)構(gòu)域及串聯(lián)體的表達(dá)、純化等研究報(bào)道，如Chen等[18]構(gòu)建SpA-ZZ原核表達(dá)系統(tǒng)，與天然SpA相比，蛋白產(chǎn)量大大提高，降低了重組SpA的生產(chǎn)成本；金慧英等[19]構(gòu)建 pET-32a-ZZ表達(dá)載體，制備SpA-ZZ-Sepharose 4B免疫吸附柱純化人和兔血清IgG，說明SpA-ZZ具有較好的抗體親和性；談珉等[20]制備的重組三聯(lián)體 SpA瓊脂糖凝膠對(duì)人IgG的吸附載量為25.1 mg/mL；陳校園等[21]制備的重組四聯(lián)體SpA瓊脂糖凝膠對(duì)人IgG的吸附載量為25 mg/mL。但是Z結(jié)構(gòu)域哪一種串聯(lián)體形式更有利于蛋白產(chǎn)量的提高以及抗體的純化目前尚無系統(tǒng)的研究。本研究中，我們構(gòu)建了不同數(shù)目串聯(lián)的 Z結(jié)構(gòu)域串聯(lián)體，系統(tǒng)比較SpA-Z結(jié)構(gòu)域二串體、三串體、四串體和五串體在原核表達(dá)系統(tǒng)中的蛋白產(chǎn)量及其偶聯(lián)的親和介質(zhì)對(duì)抗體吸附載量，為獲得更有利于抗體純化的重組蛋白串聯(lián)體形式提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

E. coliDH5α，E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞和pET-22b克隆載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑

T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、SalⅠ、Hind Ⅲ均購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Tiangen公司；咪唑購(gòu)自西安晶彩生物科技有限公司；人免疫球蛋白購(gòu)自蘭州生物制品研究所；商品化SpA瓊脂糖凝膠 (Protein A Sepharose CL-4B) 和瓊脂糖凝膠4B (Sepharose 4B) 均購(gòu)自GE公司；Ni2+親和純化柱購(gòu)于西安交大保賽生物技術(shù)股份有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 Z結(jié)構(gòu)域串聯(lián)體的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子和 Z結(jié)構(gòu)域單體氨基酸序列[10-11,22-23]，從頭設(shè)計(jì)并合成新的Z結(jié)構(gòu)域單體基因序列，序列兩端是SalⅠ酶切位點(diǎn)，用于基因單體的串聯(lián)。先用NdeⅠ/HindⅢ雙酶切將 Z結(jié)構(gòu)域基因單體切下，與經(jīng)同樣雙酶切的載體pET-22b連接，轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α，篩選具有氨芐青霉素 (Amp) 抗性的轉(zhuǎn)化子。利用pET-22b載體中測(cè)序引物 (表 1) 對(duì)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定含有Z結(jié)構(gòu)域單體表達(dá)載體的菌落。提取陽性克隆的質(zhì)粒，進(jìn)行NdeⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，獲得表達(dá)載體pET-22b-Z并測(cè)序。

將pET-22b-Z質(zhì)粒以SalⅠ酶切，回收單體片段后先自連 1 h，再與經(jīng)同樣酶切處理的pET-22b-Z載體大片段連接，轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α。經(jīng)菌落 PCR、雙酶切鑒定含有二、三、四、五串體表達(dá)載體的陽性克隆并測(cè)序，最終獲得正確的二-五串體的表達(dá)載體，分別命名為pET-22b-ZZ 、 pET-22b-ZⅢ 、 pET-22b-ZⅣ 和pET-22b-Z (Ⅴ圖2)。將上述表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至E. coliBL21，獲得相應(yīng)的基因工程菌。

表1 陽性克隆PCR擴(kuò)增使用引物Table 1 Primer sequences for PCR amplification of the positive clones

圖2 Z結(jié)構(gòu)域串聯(lián)體構(gòu)建Fig. 2 Construction of tandem repeats of the Z domain.

1.2.2 重組 Z結(jié)構(gòu)域單體及二-五串體蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組 Z結(jié)構(gòu)域單體及二-五串體工程菌株分別接入 LB 培養(yǎng)基 (100 μg/mL Amp)，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，加入乳糖 (終濃度為0.5%，W/V)繼續(xù)振蕩 4 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，離心收集菌體沉淀。收集的菌體用 PBS溶液重懸，超聲破碎細(xì)胞20 min，離心收集上清，用Ni2+親和層析柱純化。用PBS沖洗填料至平衡，將蛋白樣品流經(jīng)填料，先用含20 mmol/L咪唑的PBS洗脫雜質(zhì)，再用含200 mmol/L咪唑的PBS洗脫目的蛋白，純化的目標(biāo)蛋白對(duì)水透析后凍干保存。15%SDS-PAGE電泳后凝膠掃描對(duì)蛋白進(jìn)行純度鑒定。以上純化實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.3 重組二-五串體蛋白瓊脂糖凝膠的制備

在裝有 4 ℃冰水浴的反應(yīng)瓶中加入經(jīng)去離子水洗滌的Sepharose 4B，加入等體積的2 mol/L碳酸鹽溶液 (pH 10.9)，攪拌一段時(shí)間，讓瓶?jī)?nèi)反應(yīng)物冷至4 ℃。一次性加入CNBr-乙腈溶液 (每毫升凝膠加 CNBr 100~300 mg)，攪拌10~15 min?？焖儆蒙靶韭┒愤^濾，用冷的去離子水洗到中性，得到活化的Sepharose 4B。將活化好的Sepharose 4B裝入小三角瓶?jī)?nèi)，加入等體積的0.1 mol/L碳酸鹽緩沖溶液，攪拌下加入配基 (二-五串體蛋白，加入量為 20 mg/mL活化微球)，4 ℃冰水浴下反應(yīng)24 h。反應(yīng)終止后，以1 mol/L NaCl溶液洗去未偶聯(lián)的配基，去離子水洗至中性，乙醇洗2次，再用水洗，得到重組 SpA-Z結(jié)構(gòu)域串聯(lián)體偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠。

1.2.4 重組二-五串體蛋白凝膠親和介質(zhì)對(duì)人血清吸附試驗(yàn)

1.2.5 結(jié)果計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

摩爾蛋白吸附載量按以下公式計(jì)算：

對(duì)于多次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±s) 形式表達(dá)，應(yīng)用 SPSS13.0軟件分析，采用t檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Z結(jié)構(gòu)域單體及二-五串體表達(dá)載體的構(gòu)建

以含有Z結(jié)構(gòu)域基因單體、二串體、三串體、四串體和五串體質(zhì)粒DNA的陽性克隆為模板，利用 pET-22b載體測(cè)序引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增理論值分別為382 bp、556 bp、730 bp、904 bp、1 078 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分別在相應(yīng)處有顯著條帶 (圖 3A)，與擴(kuò)增產(chǎn)物大小的理論值一致。對(duì)陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行NdeⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，目的片段大小理論值分別為 180 bp、354 bp、528 bp、702 bp、876 bp，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，分別在相應(yīng)處有顯著條帶(圖3B)，與目的基因理論值相一致。測(cè)序結(jié)果顯示克隆結(jié)果正確，最終獲得Z結(jié)構(gòu)域基因單體及二-五串體表達(dá)載體。

圖3 Z結(jié)構(gòu)域單體和二-五串體載體的構(gòu)建Fig. 3 Construction and restriction analysis of vectors of monomer and two-five tandem repeats. (A) Monomer and two-five tandem repeats PCR amplificaion. M： DNA marker (DL 2 000); 1?5： monomer, two, three, four and five tandem repeats PCR products. (B) Restriction analysis of plasmids of monomer and two-five tandem repeats. M： DNA marker (DL 2 000); 1?5： plasmids of monomer, two, three, four and five tandem repeats digested with NdeⅠ and Hind Ⅲ.

2.2 重組Z結(jié)構(gòu)域單體及二-五串體蛋白表達(dá)和純化

乳糖誘導(dǎo) Z結(jié)構(gòu)域單體及二-五串體蛋白表達(dá)，目的蛋白分子量理論值分別為 8.3 kDa、14.9 kDa、21.6 kDa、28.2 kDa、34.8 kDa，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，相應(yīng)處的條帶明顯增強(qiáng)(圖 4)，該蛋白條帶的分子量與理論分子量相一致，初步判定重組蛋白獲得大量表達(dá)。將工程菌超聲破碎后，SDS-PAGE顯示目的蛋白存在于破碎上清中，進(jìn)一步判定目的蛋白為可溶性表達(dá)，破碎后上清液經(jīng)Ni2+親和柱純化，凝膠掃描洗脫后的蛋白純度大于90% (圖5A，B，C)。

2.3 重組Z結(jié)構(gòu)域單體及二-五串體蛋白產(chǎn)量比較

將純化后的重組蛋白冷凍干燥，獲得的蛋白凍干粉產(chǎn)量如表2所示，其中，四串體和五串體蛋白產(chǎn)量相近，分別為160.0 mg/10 g濕菌體和152.3 mg/10 g濕菌體，是單體蛋白產(chǎn)量的2倍多，與二串體和三串體蛋白產(chǎn)量相比也有明顯增高。說明適當(dāng)增加 Z結(jié)構(gòu)域基因單體的串聯(lián)數(shù)，能夠有效提高重組蛋白產(chǎn)量，降低重組蛋白的生產(chǎn)成本。

圖4 Z結(jié)構(gòu)域單體和二-五串體蛋白表達(dá)Fig. 4 Expression of the proteins with monomer and two-five tandem repeats of the Z domain. M： protein marker; 1： no-induced protein; 2?6： the proteins with monomer, two, three, four and five tandem repeats.

圖5 Z結(jié)構(gòu)域單體和二-五串體蛋白純化Fig. 5 Purification of the proteins with monomer and two-five tandem repeats of the Z domain. (A) Four tandem repeats protein Ni2+ affinity chromatography map. 1： flow-through peak of Ni2+ column; 2： elution peak (20 mmol/L imidazole); 3： elution peak (200 mmol/L imidazole). (B) SDS-PAGE analysis of purification of the protein with four tandem repeats. M： protein marker; 1： flow-through; 2： eluent at 20 mmol/L imidazole; 3： eluent at 200 mmol/L imidazole. (C) SDS-PAGE analysis of the purified proteins with monomer and two-five tandem repeats. M： protein marker; 1?5： the proteins with five, four, three, two tandem repeats and monomer.

表2 Z結(jié)構(gòu)域單體及二-五串體蛋白產(chǎn)量Table 2 Protein yield of monomer and two-five tandem repeats of the Z domain

2.4 重組Z結(jié)構(gòu)域二-五串體蛋白凝膠親和介質(zhì)對(duì)人IgG吸附載量測(cè)定

制備的凝膠親和介質(zhì)用于人IgG吸附載量測(cè)定，結(jié)果顯示，二-五串體蛋白凝膠親和介質(zhì)能特異性吸附人IgG，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化后的抗體重鏈和輕鏈分子量分別為 50 kDa和25 kDa (圖6A，B)。重組蛋白凝膠親和介質(zhì)對(duì)人IgG的吸附載量如表3所示。結(jié)果表明，四串體蛋白凝膠親和介質(zhì)對(duì)人IgG的吸附載量最高，達(dá)34.4 mg IgG/mL膠，二串體的抗體載量最低，為12.8 mg IgG/mL膠。根據(jù)4個(gè)串聯(lián)體的分子量大小計(jì)算出摩爾蛋白吸附量比值為1.0∶2.6∶5.4∶4.9，說明在重組蛋白等摩爾的條件下，四串體和五串體蛋白凝膠介質(zhì)對(duì)抗體的吸附量相近，是二串體和三串體蛋白吸附量的5倍和2倍左右。雖然在相同摩爾數(shù)下，四串體和五串體蛋白凝膠介質(zhì)對(duì)抗體的吸附量相近，但是從蛋白產(chǎn)量和抗體吸附載量變化曲線可知 (圖7)，四串體與五串體蛋白產(chǎn)量相當(dāng)，偶聯(lián)后相同質(zhì)量的四串體吸附量最大。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得商品化 SpA瓊脂糖凝膠親和介

質(zhì)對(duì)人IgG的吸附載量為20.1 mg/mL膠 (GE產(chǎn)品資料顯示每毫升凝膠偶聯(lián)的配基為3 mg/mL 膠)。

圖6 四串體蛋白凝膠親和介質(zhì)對(duì)人IgG分離純化Fig. 6 The protein with four tandem repeats Sepharose 4B affinity matrix for purification of human IgG. (A) Human IgG affinity chromatography map. 1： flow-through peak; 2： elution peak. (B) SDS-PAGE analysis of purification of human IgG. M： protein marker; 1： IgG heavy chain (50 kDa) and light chain (25 kDa).

表3 重組蛋白凝膠親和介質(zhì)對(duì)人IgG吸附載量Table 3 Amount of human IgG absorption of recombinant proteins Sepharose 4B affinity matrices

圖7 Z結(jié)構(gòu)域串聯(lián)體蛋白產(chǎn)量和吸附載量變化趨勢(shì)Fig. 7 Change trend in yield and absorption amount of the proteins with different tandem repeats. n=4.

3 討論

Z結(jié)構(gòu)域因缺少蛋氨酸和甘氨酸，能大大提高配基對(duì)CNBr和羥胺的耐受性以及與IgG結(jié)合的能力，因此，Z結(jié)構(gòu)域作為抗體親和層析介質(zhì)的配基，在抗體分離純化中應(yīng)用十分重要。本研究成功構(gòu)建了 SpA-Z結(jié)構(gòu)域基因單體及二-五串體基因工程菌，并對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行有效表達(dá)和純化。在重組蛋白C末端引入6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，通過 Ni2+親和層析一步即可獲得純度較高的目的蛋白，大大簡(jiǎn)化了蛋白的純化過程。此外，將純化后的目標(biāo)蛋白偶聯(lián)至 CNBr活化的瓊脂糖凝膠，制備的重組二-五串體蛋白凝膠親和介質(zhì)可對(duì)人IgG進(jìn)行有效吸附和純化。

本研究通過比較純化的重組Z結(jié)構(gòu)域單體、二-五串體蛋白凍干粉量可知，Z結(jié)構(gòu)域串聯(lián)個(gè)數(shù)的增加，能有效提高重組蛋白產(chǎn)量，其中獲得的四串體和五串體蛋白凍干粉量是單體的 2倍之多，無論從蛋白表達(dá)、純化效率以及生產(chǎn)成本來說，都優(yōu)于其他幾種蛋白串聯(lián)體形式。通過系統(tǒng)比較重組二-五串體蛋白凝膠親和介質(zhì)對(duì)人 IgG吸附載量可知，隨著Z結(jié)構(gòu)域串聯(lián)個(gè)數(shù)的增加，摩爾蛋白吸附量亦逐步增高，四串體和五串體的摩爾蛋白吸附量比值 (5.4，4.9) 明顯高于二串體和三串體 (1.0，2.6)，分析其原因：1) 四串體和五串體含有更多的抗體結(jié)合域；2) CNBr活化的瓊脂糖載體通過脂肪族氨基與配基偶聯(lián)，當(dāng)小分子量的配基偶聯(lián)時(shí)，配基偶聯(lián)密度較高，較多的功能基團(tuán)被占據(jù)，空間位阻增大，不利于目標(biāo)抗體與配基的結(jié)合[24-27]。此外，五串體蛋白偶聯(lián)的凝膠對(duì)抗體吸附量低于四串體，分析其原因可能是：一方面，CNBr活化瓊脂糖載體時(shí)，由于活化臂短，大分子配基不利于偶聯(lián)；另一方面，雖然相同摩爾數(shù)的五串體和四串體吸附載量相當(dāng)(分別為0.15 mg和0.17 mg)，但是單位體積凝膠中偶聯(lián)的五串體摩爾濃度 (154.9 nmol) 少于四串體 (208.9 nmol)，因此五串體偶聯(lián)的凝膠對(duì)抗體的吸附載量低于四串體。分析結(jié)果表明雖然四串體與五串體相比，蛋白產(chǎn)量和相同摩爾數(shù)蛋白與抗體的吸附載量相差不大，但是在親和介質(zhì)制備中，若獲得相同吸附載量的凝膠，四串體的蛋白使用量?jī)H為五串體的80%。因此無論是對(duì)抗體吸附效率還是使用成本方面，四串體更適合抗體親和介質(zhì)的制備。

綜上所述，本研究通過系統(tǒng)比較重組Z結(jié)構(gòu)域基因單體、二-五串體蛋白產(chǎn)量，以及重組蛋白凝膠親和介質(zhì)對(duì)人IgG吸附載量，確定了重組四串體具有蛋白產(chǎn)量高、抗體吸附量大、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，更適合作為配基用于親和層析介質(zhì)的制備，為抗體純化領(lǐng)域提供一種價(jià)格便宜、高效的重組SpA提供依據(jù)。

[1]Ghose S, Allen M, Hubbard B, et al. Antibody variable region interactions with protein A：implications for the development of generic purification processes. Biotechonol Bioeng, 2005,92(6)： 665?673.

[2]Li ZH, Yue YY, Li P, et al. Prokaryotic expression ofStaphylococalprotein A and initial study of the affinity. Chin J Shandong Univ： Health Sci, 2009,47(10)： 28?30.

李志會(huì), 岳盈盈, 李鵬, 等. 金黃色葡萄球菌蛋白 A 的原核表達(dá)及生物親和特性研究. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版, 2009, 47(10)： 28?30.

[3]Richman DD, Cleveland PH, Oxman MN, et al.The binding ofStaphylococcalprotein A by the sera of different animal species. J Immunol, 1982,128(5)： 2300?2305.

[4]Hober S, Nord K, Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007, 848(1)： 40?47.

[5]Linhult M, Gülich S, Hober S. Affinity ligands for industrial protein purification. Protein Pept Lett,2005, 12(4)： 305?310.

[6]Gagnon P. Purification Tools for Monoclonal Antibodies. Tucson, AZ： Validated Biosystems,1996： 155?158.

[7]Pang SK, Liang H, Song S L, et al. Activity mechanisms and modern application ofStaphylococcusprotein A. Chin Chem Life, 2008,28(6)： 748?751.

逢少堃, 梁浩, 宋淑亮, 等. 葡萄球菌蛋白 A 活性機(jī)制與現(xiàn)代應(yīng)用. 生命的化學(xué), 2008, 28(6)：748?751.

[8]Li RX, Dowd V, Stewart DJ, et al. Design,synthesis, and application of a protein A mimetic.Nat Biotechnol, 1998, 16(2)： 190?195.

[9]Bottomley SP, Sutton BJ, Gore MG. Elution of human IgG from affinity columns containing immobilised variants of protein A. J Immunol Methods, 1995, 182(2)： 185?192.

[10]Gülich S, Uhlén M, Hober S. Protein engineering of an IgG-binding domain allows milder elution conditions during affinity chromatography. J Biotechnol, 2000, 76(2/3)： 233?244.

[11]Nilsson B, Moks T, Jansson B, et al. A synthetic IgG-binding domain based onStaphylococcalprotein A. Protein Eng, 1987, 1(2)： 107?113.

[12]Nilsson B, Forsberg G, Moks T, et al. Fusion proteins in biothechnology and structural biology.Curr Opin Biotechnol, 1992, 2(4)： 569?575.

[13]Graille M, Stura EA, Corper AL, et al. Crystal structure of aStaphylococcus aureusprotein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody： structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(10)：5399?5404.

[14]Linhult M, Gülich S, Gr?slund T, et al. Improving the tolerance of a protein A analogue to repeated alkaline exposures using a bypass mutagenesis approach. Proteins, 2004, 55(2)： 407?416.

[15]Tashiro M, Montelione GT. Structures of bacterial immunoglobulin-binding domains and their complexes with immunoglobulins. Curr Opin Struct Biol,1995, 5(4)： 471?481.

[16]Braisted AC, Wells JA. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93(12)： 5688?5692.

[17]Ljungquist C, Jansson B, Moks T, et al.Thiol-directed immobilization of recombinant IgG-binding receptors. Eur J Biochem, 1989,186(3)： 557?561.

[18]Chen C, Huang QL, Jiang SH, et al. Immobilized protein ZZ, an affinity tool for immunoglobulin isolation and immunological experimentation.Biotechnol Appl Biochem, 2006, 45(Pt 2)： 87?92.

[19]Jin HY, Tang ZH. Cloning, expression and purification ofStaphylococcalprotein A antibody-binding ftraction gene. Chin J Biochem Pharm, 2009, 30(1)： 38?40.

金慧英, 唐治華. 葡萄球菌蛋白A抗體結(jié)合區(qū)基因的克隆、表達(dá)和純化. 中國(guó)生化藥物雜志,2009, 30(1)： 38?40.

[20]Tan M, Hu H, Guo YJ. Preparation method and application of recombinant protein A gene and expression product： China, CN101050464A.2007-10-10.

談珉, 胡輝, 郭亞軍. 一種重組蛋白 A基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備方法和用途： 中國(guó),CN101050464A. 2007-10-10.

[21]Chen XY, Yu BG, Peng T, et al. Construction method and application of artificial recombinant quadruplet protein A： China, CN101298476A.2008-11-05.

陳校園, 余波光, 彭濤, 等. 人工重組的四聯(lián)體蛋白 A 及其構(gòu)建方法與用途： 中國(guó),CN101298476A. 2008-11-05.

[22]Cedergren L, Andersson R, Jansson B, et al.Mutational analysis of the interaction betweenStaphylococcalprotein A and human IgG1. Protein Eng, 1993, 6(4)： 441?448.

[23]Tashiro M, Tejero R, Zimmerman DE, et al.High-resolution solution NMR structure of the Z domain ofStaphylococcalprotein A. J Mol Biol,1997, 272(4)： 573?590.

[24]Jendeberg L, Tashiro M, Tejero R, et al. The mechanism of bindingStaphylococcalprotein A to immunoglobin g does not involve helix unwinding.Biochem, 1996, 35(1)： 22?31.

[25]Kennedy JF, Barnes JA. Assessment of the use of cyanogen bromide-activated sepharose in analytical and preparative immunoadsorption. Int J Biol Macromol, 1980, 2(5)： 289?296.

[26]Huse K, B?hme HJ, Scholz GH. Purification of antibodies by affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods, 2002, 51(3)： 217?231.

[27]Darcy E, Leonard P, Fitzgerald J, et al. Purification of antibodies using affinity chromatography.Methods Mol Biol, 2011, 681： 369?382.