三七皂甙Rg1對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷的防護(hù)作用

李劍瑜 劉毅 高波 戴富林 武凡

現(xiàn)在廣泛認(rèn)為脂多糖（liposaccharide，LPS）是導(dǎo)致膿毒血癥、敗血癥休克的直接原因，并可導(dǎo)致多功能不全綜合征（multi organ dysfunction syndrome，MODS）發(fā)生，而肝臟則是MODS最早受損和受損最為嚴(yán)重的臟器［1，2］。由于缺乏簡(jiǎn)便有效的治療藥物，對(duì)MODS的治療至今未取得突破性的進(jìn)展。三七皂甙Rg1是中國(guó)傳統(tǒng)中草藥三七的單體成分，其對(duì)急性肝損傷的作用和保護(hù)機(jī)理，目前鮮見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)用透射電鏡、DNA凝膠電泳、單細(xì)胞凝膠電泳法（single cell gel electrophoresis assay，SCGE，又稱慧星電泳）探討LPS所致肝細(xì)胞損害的特點(diǎn)，并探討三七皂甙Rg1抗肝細(xì)胞損害的作用及作用機(jī)理，為急性肝細(xì)胞損傷的治療決策提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LPS、膠原酶Ⅳ、percoll均購(gòu)自sigma公司；triton x－100購(gòu)于Furka公司，三七皂甙Rg1為昆明植物研究所產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠32只，體重（200±12）g。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肝細(xì)胞分離與純化 膠原酶原位灌流法分離大鼠肝細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。取Wistar大鼠32只，隨機(jī)分為4組，每組8只，膠原酶原位灌流法分離大鼠肝細(xì)胞后用臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞存活率＞90%，計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為106個(gè)／ml。于正常對(duì)照組、LPS組、LPS＋Rg1組、LPS＋Quinacrine組分別加入20mmol／L PBS、3mg／L LPS、3mg／L LPS＋20mmol／LRg1、3mg／L LPS＋5μmol／L Quinaceine，于施加因素后0、2、4、6、8、12小時(shí)分別收集肝細(xì)胞和肝細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 透射電鏡觀察 肝細(xì)胞收獲后，離心棄上清，PBS漂洗三次，2%戊二醛液固定，1mol／L二甲砷酸緩沖液漂洗，1%四氧化鋨固定，丙酮系列脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片染色后觀察。

1.3.3 DNA 片段的提取 參照文獻(xiàn)［4］提取培養(yǎng)肝細(xì)胞的DNA片段，經(jīng)空氣干燥后，溶于20μl的雙蒸水中，4℃保存。用于DNA梯度電泳。

1.3.4 SCGE檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［3］并加以改進(jìn)。于45℃，100μl 1%正常熔點(diǎn)瓊脂糖的無(wú)Ca2＋、Mg2＋PBS懸液澆注到磨粗的Dakin載玻片上將純化后的肝細(xì)胞進(jìn)行固化成三層。然后將玻片置水平電泳槽液面下0.25cm，在堿性電泳緩沖液中放置20分鐘后25V，300mA，電泳20分鐘。用0.4mol／L Tris（pH 7.5）浸洗，每次15分鐘，共3次，然后用溴化乙錠水溶液染色。染色后的單個(gè)肝細(xì)胞應(yīng)盡快在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包。SCGE玻片用CM－2000B彩色醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)分析。數(shù)據(jù)用±s表示，并經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)以及方差齊性檢驗(yàn)。凋亡與壞死的時(shí)相性變化相關(guān)分析采用pearson's檢驗(yàn)。Rg1對(duì)大鼠肝細(xì)胞損害的抑制作用數(shù)據(jù)采用方差分析和組間q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

大鼠肝細(xì)胞在加入LPS（終濃度3mg／L）后培養(yǎng)2小時(shí)，透射電鏡下觀察，圖1可見(jiàn)較早期調(diào)亡的肝細(xì)胞。染色質(zhì)固縮聚集于核膜，呈境界分明的塊狀或新月?tīng)?，在上方可?jiàn)一個(gè)較小的凋亡小體。圖2可見(jiàn)正在形成凋亡小體的肝細(xì)胞，該細(xì)胞胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞周?chē)写笮〔坏鹊牡蛲鲂◇w。

圖1 LPS處理2小時(shí)后肝細(xì)胞凋亡的電鏡檢測(cè)（×6000）

圖2 LPS處理2小時(shí)后肝細(xì)胞凋亡的電鏡檢測(cè)（×3500）

2.2 DNA梯度電泳

各組大鼠肝細(xì)胞在加入施加因素后于4小時(shí)后提取細(xì)胞DNA，在1.5%的瓊脂糖上電泳，35V，電泳2小時(shí)，泳道1為marker，泳道2和3為L(zhǎng)PS組，泳道4為L(zhǎng)PS＋Rg1組、泳道5為L(zhǎng)PS＋Quinacrine組，泳道6為正常對(duì)照組，泳道2和3均出現(xiàn)典型的梯狀條帶，說(shuō)明有明顯的凋亡現(xiàn)象，泳道4和泳道5的條帶顏色較淺，說(shuō)明凋亡細(xì)胞明顯減少，而泳道6對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象，說(shuō)明沒(méi)有凋亡細(xì)胞（見(jiàn)圖3）。

圖3 DNA梯度電泳

2.3 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)

在通常情況下，DNA雙鏈以組蛋白為核心。盤(pán)旋形成核小體。在核小體中DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。如果有去污劑進(jìn)入細(xì)胞，核蛋白被濃鹽提取，DNA便形成殘留的類核，鏡下可見(jiàn)熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的圖形頭部，無(wú)拖尾，為正常細(xì)胞（見(jiàn)圖4A）。如果類核中DNA斷裂，就會(huì)在核外形成一個(gè)DNA暈輪，DNA斷裂將引起超螺旋松散，電泳時(shí)DNA斷裂片向陽(yáng)極伸展，形成特征性慧星（見(jiàn)圖4C）。細(xì)胞凋亡時(shí)DNA在質(zhì)膜損傷以前斷裂，這種斷裂很容易被這種方法顯示，被稱為“凋亡之慧星”。凋亡慧星的數(shù)量可以代表凋亡細(xì)胞的數(shù)量。在慧星電泳中，壞死細(xì)胞由于細(xì)胞膜受損，DNA隨機(jī)斷裂，形成沒(méi)有明顯頭部的拖尾（見(jiàn)圖4B）。因?yàn)榛坌请娪灸軐⒄＜?xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞定量地區(qū)分開(kāi)來(lái)，所以更有利于凋亡的深入研究。原代培養(yǎng)肝細(xì)胞于各培養(yǎng)皿中加入處理因素后培養(yǎng)0、2、4、6、8、12小時(shí)進(jìn)行電泳。圖4為電泳2小時(shí)的各組細(xì)胞，對(duì)照組為正常細(xì)胞（見(jiàn)圖4A），而LPS組為凋亡細(xì)胞（見(jiàn)圖4C），壞死細(xì)胞（見(jiàn)圖4B）。

圖4 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)

由表1可見(jiàn)用SCGE法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞損害的時(shí)相性變化，6小時(shí)內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)增加較快，8小時(shí)后壞死細(xì)胞數(shù)急劇增加，12小時(shí)壞死細(xì)胞占絕大多數(shù)。

由表2可見(jiàn)三七皂甙Rg1明顯抑制LPS所致的肝細(xì)胞凋亡與壞死，其效果與凋亡抑制劑Quinacrine無(wú)明顯差異。

表1 用SCGE法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與壞死的時(shí)相性變化（n＝8，±s，%）

表1 用SCGE法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與壞死的時(shí)相性變化（n＝8，±s，%）

注：凋亡細(xì)胞與處理時(shí)間的相關(guān)性r＝0.971，P＜0.01；壞死細(xì)胞與處理時(shí)間的相關(guān)性r＝0.941，P＜0.01。

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表2 Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)8小時(shí)大鼠肝細(xì)胞損害的抑制作用（n＝8，±s）

表2 Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)8小時(shí)大鼠肝細(xì)胞損害的抑制作用（n＝8，±s）

注：與正常對(duì)照組細(xì)胞相比aP＜0.01；與LPS組相比b P＜0.01。

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3 討論

已知認(rèn)為肝臟是LPS導(dǎo)致受損最為嚴(yán)重的器官［1，2］，但受損的性質(zhì)和機(jī)制尚存在爭(zhēng)議［5］，更缺乏有效的治療藥物。三七皂甙具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用，但對(duì)急性肝細(xì)胞損傷的作用機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。在本實(shí)驗(yàn)中，用LPS（3mg／L）處理原代培養(yǎng)肝細(xì)胞2小時(shí)，電鏡可見(jiàn)典型的凋亡細(xì)胞和凋亡小體。DNA凝膠電泳也表現(xiàn)明顯的凋亡梯度，用SCGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS（3mg／L）處理2小時(shí)肝細(xì)胞即可得到凋亡細(xì)胞為7.2%±2.6%，壞死細(xì)胞為10.2%±2.4%，提示LPS引起的肝損害的性質(zhì)及嚴(yán)重程度。這說(shuō)明LPS可以直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與壞死。LPS引起的肝細(xì)胞損害的時(shí)相性變化，至今也未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，本資料用改進(jìn)的SCGE法做進(jìn)一步探討發(fā)現(xiàn)LPS引起的肝細(xì)胞凋亡與壞死都有顯著的時(shí)相性變化。

SCGE也叫慧星電泳，是一種直接顯示單個(gè)細(xì)胞DNA損傷的微電泳技術(shù)［2，6］。但SCGE鮮見(jiàn)應(yīng)用于肝細(xì)胞損傷研究的報(bào)道。由于SCGE能將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞定量地區(qū)分開(kāi)，而且敏感性高、方法簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜，因而可以成批的檢測(cè)標(biāo)本，SCGE比起昂貴的1995年Vermas首次使用的Annexinv／pI法定量分析凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞顯示了更多的優(yōu)越性，所以有利于肝損害的研究。用SCGE檢測(cè)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，加3mg／L LPS 2小時(shí)可以觀察到明顯的肝細(xì)胞凋亡與壞死，這比最近報(bào)導(dǎo)的使用LPS 10mg／L 4小時(shí)發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞敏感的多［6］。表1顯示在8小時(shí)之內(nèi)凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞的增加與處理時(shí)間有明顯的相關(guān)性，到12小時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)急劇下降，而壞死細(xì)胞數(shù)從第8小時(shí)迅速上升，于12小時(shí)占絕大多數(shù)。本資料提示LPS誘導(dǎo)的肝臟損害是一個(gè)從肝細(xì)胞凋亡到壞死的過(guò)程。這一過(guò)程可能是細(xì)胞死亡連鎖反應(yīng)的不同階段，其原因可能在于雖然凋亡與壞死是細(xì)胞死亡的兩種不同形式，但兩者不是毫無(wú)關(guān)聯(lián)的。它們之前的交錯(cuò)在于無(wú)論哪種死亡形式，最終都伴有能量不足、大分子物質(zhì)的降解以及自由基的形成［4］，另一方面同一種誘導(dǎo)因素，如本實(shí)驗(yàn)中刺激因素LPS，由于時(shí)間的不同而導(dǎo)致連鎖反應(yīng)的兩個(gè)階段。

本資料用SCGE法表明LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損害的存在以及嚴(yán)重程度，因此尋找有效的特異治療MODS的藥物成為筆者進(jìn)一步研究的焦點(diǎn)。Quinacrine可以抑制肝損害，但考慮到Quinacrine的作用有臟器選擇性及效應(yīng)多樣性，該藥在進(jìn)入治療急性肝損傷前，仍有許多向題尚未解決［3，4］。在國(guó)外學(xué)者把MODS稱為介質(zhì)病，在用介質(zhì)療法顯得蒼白無(wú)力的時(shí)候［3］，本課題組用靈敏度高、價(jià)格便宜的SCGE對(duì)中藥進(jìn)行篩選。研究發(fā)現(xiàn)具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用的三七皂甙單體Rg1對(duì)急性肝損害有明顯抑制作用，顯著地抑制肝細(xì)胞凋亡與壞死，在治療急性肝損傷有著Quinacrine不可替代的優(yōu)越性，預(yù)示其應(yīng)用的廣泛前景。

總之，本資料提示SCGE法是研究肝細(xì)胞損害并進(jìn)行藥物篩選的良好方法。用該法筆者發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損害是一個(gè)從肝細(xì)胞凋亡到壞死的過(guò)程，并證實(shí)三七皂甙Rg1為肝細(xì)胞損害的有效的保護(hù)劑，深化了對(duì)MODS的認(rèn)識(shí)，為MODS的治療提供新的思路。

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