補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)骨髓抑制小鼠造血功能的影響

趙靜梅 楊旭輝 王廣占 竇永起

化療是惡性腫瘤治療的主要手段之一，但由于化療引起的骨髓抑制限制了化療用藥劑量和治療節(jié)奏，影響了治療效果，并容易引起嚴(yán)重感染、出血等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量并威脅患者生命。近年來(lái)出現(xiàn)的各種細(xì)胞集落刺激因子，雖然具有見(jiàn)效快、有效率高、應(yīng)用普遍等優(yōu)點(diǎn)，但費(fèi)用高昂、副作用多、效果不持久。中醫(yī)學(xué)多將化療后骨髓抑制歸于脾腎兩虛、氣血不足［1，2］，臨床多以益氣補(bǔ)血為主要的治療方法，但療效還不盡理想。筆者在多年臨床實(shí)踐中體會(huì)到在補(bǔ)腎基礎(chǔ)上配合解毒活血藥效果會(huì)更好，但其作用機(jī)制不明，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究也罕有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)骨髓抑制的影響，并對(duì)其作用機(jī)理作了初步探討。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18～22g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（軍）2007－004，生產(chǎn)條件許可證：SYXK（軍）2007－004。

1.2 主要試劑與儀器

MethoCult?03534培 養(yǎng) 基 和 MethoCult?03334培養(yǎng)基（加拿大StemCell Technologies公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱：DH4000A（天津泰斯特）；超凈工作臺(tái)（北京昌平空氣凈化公司）；Napco－5410 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（shelden公司）；光學(xué)顯微鏡OLYMPUS（日本）；Sysmex－820自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（日本）；注射用環(huán)磷酰胺，產(chǎn)品批號(hào)10012621，規(guī)格0.2g（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。

1.3 中藥

補(bǔ)腎解毒活血中藥由熟地10g、何首烏10g、肉蓯蓉10g、苦參10g、白花蛇舌草10g、川芎15g、當(dāng)歸10g、丹參15g組成，共計(jì)90g／d。按《中藥藥理研究方法學(xué)》［3］計(jì)算小鼠的等效劑量為0.36g·kg－1·d－1。以上藥物均由解放軍總醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)鑒定后，水煎、過(guò)濾、濃縮、配制成含生藥1g／ml的藥液，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 模型制作

小鼠常規(guī)飼養(yǎng)3天適應(yīng)環(huán)境后，觀察無(wú)異常者，于次日按100mg／kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)3天，制成骨髓抑制模型小鼠。

2.2 分組與給藥

實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、模型組、中藥治療組。造模完成后次日開(kāi)始灌胃給藥，中藥治療組給予補(bǔ)腎解毒活血中藥湯液，空白對(duì)照組和模型組分別給予等體積的生理鹽水，連續(xù)10天。

2.3 外周血細(xì)胞分析

每組隨機(jī)抽取10只，于造模前1天及造模后第1、3、5、7、10、14 天，每 只 實(shí) 驗(yàn) 小 鼠 尾 靜 脈 取 血20μl，用Sysmex－820自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)外周血細(xì)胞。

2.4 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及造血祖細(xì)胞培養(yǎng)

制模后第11天，頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)」晒牵?號(hào)針頭以PBS沖出骨髓細(xì)胞，再用4號(hào)針頭過(guò)濾制成單個(gè)骨髓細(xì)胞懸液，在顯微鏡下按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。按文獻(xiàn)方法［4］進(jìn)行集落培養(yǎng)，檢測(cè)小鼠骨髓粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落生成單位（CFU－GM）、紅細(xì)胞爆裂型集落生成單位（BFU－E）、定向體外紅系集落形成單位（CFU－E）的生成能力。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間的差異顯著性分析用F檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎解毒活血湯對(duì)血虛小鼠外周血象的影響

外周血白細(xì)胞（WBC），模型組在造模后第1天降到最低點(diǎn)，與空白對(duì)照組相比差異有非常顯著性意義（P＜0.01），造模后第3天仍低于空白對(duì)照組，至第5天恢復(fù)正常，但在第7天時(shí)出現(xiàn)明顯高于正常組的“反跳”現(xiàn)象，而中藥治療組在造模后第3天雖低于空白對(duì)照組（P＜0.01），但明顯高于模型組（P＜0.01），第5天恢復(fù)正常且保持穩(wěn)定。見(jiàn)表1。

外周血血小板（PLT），模型組在造模后第5天降到最低然后回升，至第10天達(dá)到正常，而中藥治療組自第3天即開(kāi)始回升，第7天時(shí)即與空白對(duì)照組持平，且其最低值明顯高于模型組（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

各組紅細(xì)胞變化不明顯，故省略表。

3.2 補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)骨髓抑制小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和造血祖細(xì)胞集落的影響

結(jié)果顯示模型組小鼠BMNC和CFU－GM、CFU－E、BFU－E計(jì)數(shù)較空白對(duì)照組均明顯減少（P＜0.01），經(jīng)補(bǔ)腎解毒活血中藥湯液治療后，小鼠BMNC計(jì)數(shù)和 CFU－GM、CFU－E、BFU－E較模型組明顯增多（P＜0.01）。

4 討論

機(jī)體造血主要依靠造血祖細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增。造血祖細(xì)胞在多種造血因子的調(diào)控下進(jìn)一步增殖分化 ，不斷發(fā)育形成各種成熟血細(xì)胞［5］。當(dāng)受到化學(xué)藥物等損傷時(shí)，即會(huì)發(fā)生造血功能障礙，其主要原因之一是殺傷了賴以維持造血功能的造血干／祖細(xì)胞［6］，這是化療藥引起骨髓造血功能下降及外周血細(xì)胞減少的主要原因。各種血細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性取決于它們的半衰期長(zhǎng)短［7］。白細(xì)胞半衰期最短6小時(shí)，故最易受到抑制，引起白細(xì)胞減少；血小板半衰期為5～7天，亦較易引起減少；而紅細(xì)胞半衰期長(zhǎng)達(dá)120天，因此紅系祖細(xì)胞數(shù)目減少常不易從外周血紅細(xì)胞中表現(xiàn)出來(lái)。

表1 補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血WBC的影響（±s，n＝10，109／L）

表1 補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血WBC的影響（±s，n＝10，109／L）

注：與空白對(duì)照組比較aP＜0.05，b P＜0.01；與模型組比較c P＜0.05，d P＜0.01。

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表2 補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血PLT的影響（±s，n＝10，109／L）

表2 補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血PLT的影響（±s，n＝10，109／L）

注：與空白對(duì)照組比較aP＜0.05，b P＜0.01；與模型組比較c P＜0.05，d P＜0.01。

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表3 補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)造血祖細(xì)胞集落形成及骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響（±s，n＝10）

表3 補(bǔ)腎解毒活血法對(duì)造血祖細(xì)胞集落形成及骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響（±s，n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較aP＜0.05，b P＜0.01；與模型組比較c P＜0.05，d P＜0.01。

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中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血液的生成與心、脾、腎等多臟腑有關(guān)，其中與腎的關(guān)系最為密切。因腎藏精，主骨生髓，精髓化生血液。即《景岳全書(shū)》中“腎為水臟，主藏精而化血”?！稄埵厢t(yī)通》中亦有“血之源頭出于腎”之說(shuō)。因此補(bǔ)腎法是臨床常用的治療化療后骨髓抑制的方法。但臨床上單用補(bǔ)腎法治療常難以獲得預(yù)期療效，結(jié)合該病的臨床表現(xiàn)和臨床治療經(jīng)驗(yàn)，筆者認(rèn)為化療藥物為熱毒之品，邪毒內(nèi)侵，熱毒內(nèi)蘊(yùn)，瘀阻骨髓脈絡(luò)，導(dǎo)致氣血瘀滯，因此在補(bǔ)腎法的基礎(chǔ)上結(jié)合解毒和活血法治療本病，才能達(dá)到邪去而元?dú)庾詮?fù)，瘀去而氣血暢通的效果。方中熟地甘溫，補(bǔ)血養(yǎng)陰，填精益髓，善補(bǔ)腎陰，為補(bǔ)腎陰之要藥，《本草綱目》稱其能“填骨髓，長(zhǎng)肌肉，生精血，補(bǔ)五臟內(nèi)傷不足”，何首烏補(bǔ)肝腎、益精血，治血虛萎黃。《本草綱目》謂其能養(yǎng)血益肝、固精益腎。肉蓯蓉甘溫助陽(yáng)，為補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血之良藥，三藥平補(bǔ)腎之陰陽(yáng)，藥性平和，為補(bǔ)腎之良藥?？鄥⒖嗪芮鍩嵩餄窠舛?，白花蛇舌草也有較強(qiáng)的清熱解毒作用，清除蘊(yùn)積于體內(nèi)的邪熱和毒邪。川芎活血行氣為血中之氣藥，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，丹參活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，即“一味丹參散，功同四物湯”。三藥活血化瘀而生新，共同達(dá)到治療骨髓抑制的效果。

表1、表2表明，中藥治療組可以促進(jìn) WBC的恢復(fù)，且相對(duì)于模型組來(lái)說(shuō)其恢復(fù)過(guò)程較穩(wěn)定；效果更為明顯的是，中藥治療組血小板降低幅度小、持續(xù)時(shí)間短，因而提示補(bǔ)腎解毒活血法尤其能提高環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制情況下的血小板再生。表3表明，環(huán)磷酰胺可以引起紅系、粒系造血功能的下降，但由于紅細(xì)胞半衰期長(zhǎng)達(dá)120天，本實(shí)驗(yàn)外周血中未出現(xiàn)明顯變化，而補(bǔ)腎解毒活血法可顯著升高BFU－E、CFU－E和 CFU－GM 集落產(chǎn)率，從而促進(jìn)紅系和粒單系造血能力的恢復(fù)。這可能是其治療化療后骨髓抑制的有效環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，該種造模方法動(dòng)物恢復(fù)快，引起的骨髓抑制持續(xù)時(shí)間短，而由于中藥作用時(shí)間長(zhǎng)、起效慢，因而難以很好地反映出中藥防治化療后骨髓抑制的比較優(yōu)勢(shì)；另一方面，由于紅細(xì)胞半衰期長(zhǎng)達(dá)120天，本實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)明顯變化，臨床上反復(fù)化療而引起的貧血也未出現(xiàn)，故有必要考慮進(jìn)一步改進(jìn)造模方法。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示補(bǔ)腎解毒活血法治療骨髓抑制可通過(guò)增加骨髓造血祖細(xì)胞數(shù)量，從而促進(jìn)環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血 WBC、PLT的穩(wěn)定恢復(fù)。

［1］劉啟華，王旭 .益氣補(bǔ)血湯治療化療后白細(xì)胞減少89例療效觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科，2007，14（6）：447.

［2］苗文紅 .補(bǔ)腎健脾法治療腫瘤放化療后骨髓抑制98例［J］.陜西中醫(yī)，2000，21（7）：289.

［3］陳奇 .中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：11103.

［4］劉秀珍 .造血祖細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)［M］.北京：北京出版社，1993：25.

［5］牛泱平，陳小紅，宋必衛(wèi)，等 .人參二醇、三醇皂苷對(duì)小鼠骨髓造血干／祖細(xì)胞體外增殖的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20（11）：1316－1317.

［6］鄒仲敏，孫慧勤，羅成基.6Gyγ射線照射誘導(dǎo)骨髓造血細(xì)胞凋亡［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1998，18（6）：390－392.

［7］劉新春，程玉峰，李德愛(ài) .實(shí)用抗腫瘤藥物治療學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1078.