交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨復(fù)合體的生物安全性研究

席焱海，薛敏濤，葉曉健，何海龍

目前臨床上對(duì)于結(jié)核病灶清除術(shù)后的骨組織缺損理想的治療策略就是設(shè)計(jì)具有促進(jìn)骨缺損組織修復(fù)作用并且同時(shí)可以長效緩釋抗結(jié)核藥物的人工骨填充緩釋材料，這樣就可以在促進(jìn)骨組織再生修復(fù)骨缺損的同時(shí)維持局部有效的抗結(jié)核藥物濃度，有助于骨移植物周圍骨組織再生的同時(shí)抑制局部結(jié)核桿菌的繁殖，從而避免局部結(jié)核病灶的復(fù)發(fā)，促進(jìn)患者的康復(fù)［1］。本研究將磷酸三鈣生物陶瓷(tricalcium phosphate bioceramics，TPB) 人工骨支架與一定濃度的海藻酸鈉(sodium alginate ，SA) 、氯化鈣水溶液、抗結(jié)核藥利福平(rifampicine，RFP) 相混合，利用SA 在鈣離子作用下的自組裝特性制備成TPB/SA-RFP 抗結(jié)核藥物微球復(fù)合體，并將此復(fù)合體分別用聚乳酸(poly lactic acid，PLA) 、PLA 與羥基乙酸共聚物［poly (lactic-co-glycolic acid) ，PLGA］或聚乙內(nèi)酯［poly (ε-caprolactone) ，PCL］進(jìn)行表面涂層化處理，從而最終制備出交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨 TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合體。在對(duì)其骨修復(fù)活性進(jìn)行測試之前，分別進(jìn)行了復(fù)MTT 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、急性全身毒性實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)及致敏實(shí)驗(yàn)，并與對(duì)照組比較，對(duì)其生物安全性進(jìn)行初步測試，以證實(shí)其安全可靠。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合體制備：稱取質(zhì)量百分比濃度為1 mg/mL 的SA 10 g，濃度為0.2%的RFP 5 g，氯化鈣10 g，TPB 50 mg(10 mm×5 mm×5 mm) 加入到500 mL PBS(pH 7.4) 溶液中混合靜止，48 h 后將該混合物取出晾干，然后加入到500 mL 濃度為5 mg/mL 的氯化鈣水溶液中1 min，即可制得TPB/SA-RFP 抗結(jié)核藥物微球復(fù)合體。然后將TPB/SA-RFP 抗結(jié)核藥物微球復(fù)合體和質(zhì)量百分比濃度為5%的PLA、PLGA 或PCL 浸入500 mL的氯仿溶液中2 h，最后將其取出烘干，揮發(fā)除去溶劑，即可得到實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合體MTT 細(xì)胞毒性的測定

制備實(shí)驗(yàn)用浸提液。以MC-3T3 為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，分別測定陰性對(duì)照組(單純TPB) 、陽性對(duì)照組(RFP 直接給藥) 、實(shí)驗(yàn)組［TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合體］對(duì)MC-3T3 的毒性。用α-MEM 培養(yǎng)基在37℃、5% CO2環(huán)境下按材料表面積/溶液量(cm2/mL) =2.0(ISO 標(biāo)準(zhǔn)：0.5～6.0 cm2/mL) 的比例對(duì)各組材料進(jìn)行浸提72 h，之后收集原始浸提液，然后用0.2 μm的微孔濾膜過濾除菌。以α-MEM 培養(yǎng)基作為稀釋液，將浸提液按比例逐步稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度(RFP 濃度) ，作為實(shí)驗(yàn)用浸提液。各組RFP 濃度為：陰性對(duì)照組不含RFP;陽性對(duì)照組RFP 濃度有3 種，10 μg/mL、20 μg/mL 和40 μg/mL;實(shí)驗(yàn)組3 種材料所含RFP 濃度均為1 mg/mL。

培養(yǎng)MC-3T3-E1 細(xì)胞(以上各組細(xì)胞培養(yǎng)制備過程相同) 。在50 mL α-MEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)MC-3T3-E1 細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層后傳代，棄去培養(yǎng)液，加入0.25%的胰酶消化液，在37℃消化1～2 min，加入少量的α-MEM 培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散均勻，制成細(xì)胞懸液，種植到96 孔板中培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)基備用。

測量吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。取50 μL 實(shí)驗(yàn)用浸提液及50 μL 的α-MEM 培養(yǎng)基加入MC-3T3-E1 細(xì)胞作為a 組;取100 μL 的α-MEM 培養(yǎng)基不加入浸提液及細(xì)胞作為b 組; 取100 μL 的α-MEM 培養(yǎng)基不加入浸提液直接加入MC-3T3-E1 細(xì)胞作為c組。本步驟中的3 組在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7 d后，每孔加入20 μL的MTT 試劑，反應(yīng)4 h 后每孔加入100 μL DMSO，反應(yīng)10 min 后置入到酶標(biāo)儀中，在490 nm 波長下檢測每孔的吸光度(A) ，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)6 次。計(jì)算活細(xì)胞的存活率(survival rate，SR) ，SR=(Aa-Ab) /(Ac-Ab) ×100%。最后轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的細(xì)胞毒性等級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)為：0 級(jí)為≥100%;1 級(jí)為≥75%且＜100%; 2 級(jí)為≥50%且＜75%; 3 級(jí)為≥25%且＜50%;4 級(jí)為＞0%且＜25%;5 級(jí)為≤0%。

1.2.2 致敏實(shí)驗(yàn)

選擇健康成年豚鼠19 只，其中實(shí)驗(yàn)組9 只，陰性、陽性對(duì)照組各5 只，體重300～360 g。事先將1 g復(fù)合材料于生理鹽水中浸提72 h(37℃) ，獲材料浸液備用。實(shí)驗(yàn)組在每只動(dòng)物兩側(cè)肩胛骨內(nèi)緣處皮內(nèi)注射浸取液0.1 mL; 陰性對(duì)照組注射生理鹽水0.1 mL;陽性對(duì)照組注射2%二硝基氟苯0.1 mL。于注射完成即刻、注射后24 h、48 h 和72 h 觀察皮膚反應(yīng)(見表1) 。陽性反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)＞30%判定受試物為變態(tài)反應(yīng)陽性。

表1 皮膚反應(yīng)分類標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Skin reaction classification criteria

1.2.3 原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)

選擇健康新西蘭兔6 只，雌雄各3 只，體重2.0～2.5 kg。實(shí)驗(yàn)前于兔脊柱兩側(cè)各選2 個(gè)面積為3 cm×3 cm 的備皮區(qū)(共12 片，6 片實(shí)驗(yàn)組，3 片陽性對(duì)照組，3 片陰性對(duì)照組) ，間距10 cm。實(shí)驗(yàn)前24 h 用8%的硫化鈉溶液脫毛。事先將1 g 復(fù)合材料制備成浸提液(同致敏實(shí)驗(yàn)) 。濾紙充分吸附復(fù)合材料的浸提液至飽和，貼敷于消毒后的實(shí)驗(yàn)部位;使用生理鹽水浸提后作為陰性對(duì)照;3.5%甲醛溶液作為陽性對(duì)照。固定貼敷24 h 后，移去貼敷物，用溫水清潔貼敷區(qū)并吸干，觀察移去貼敷物后24 h、48 h和72 h 皮膚的紅斑及水腫情況。計(jì)算原發(fā)刺激指數(shù)(primary stimulus index，PSI) ，參考表1 進(jìn)行記分并評(píng)價(jià)。具體方法為：PSI =(24 h、48 h 和72 h 的紅斑、水腫總分) /注射點(diǎn)總數(shù)。＜0.5 分為無刺激;≥0.5 且＜2.0 分為輕度刺激;≥2.0 且＜5.0分為中度刺激; ＞5.0 且≤8.0 分為強(qiáng)刺激。

1.2.4 皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)

采用健康新西蘭兔4 只，雌雄各2 只，體重2.0～2.5 kg。事先將1g 復(fù)合材料復(fù)合材料制備成浸提液(同致敏實(shí)驗(yàn)) 。實(shí)驗(yàn)前24 h 用8%的硫化鈉溶液將兔脊柱兩側(cè)各5 cm×25 cm 區(qū)域脫毛。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱兩側(cè)旁開2.5 cm 縱線上各取10 個(gè)皮內(nèi)注射點(diǎn)，每點(diǎn)間距2 cm。一側(cè)注射復(fù)合材料浸提液0.2 mL，另一側(cè)注射生理鹽水0.2 mL 作為對(duì)照。注射后即刻、24 h、48 h 和72 h 觀察局部及周圍皮膚組織反應(yīng)，并按表1 所列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記分，再根據(jù)記分結(jié)果推算PSI 和平均原發(fā)刺激指數(shù)(average primary stimulus index，APSI) ，APSI =所有動(dòng)物PSI 總和/動(dòng)物數(shù)。

1.2.5 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)

采用健康小鼠16 只，雌雄各8 只，體重為150～200 g。將動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)材料組和對(duì)照組，每組8 只。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物由尾靜脈注射復(fù)合材料生理鹽水浸提液(制備過程同致敏實(shí)驗(yàn)) ，劑量為50 mL/kg。對(duì)照組動(dòng)物由尾靜脈注射的生理鹽水，劑量為50 mL/kg。于注射后24 h、48 h 和72 h 觀察所有動(dòng)物的一般情況、中毒表現(xiàn)和死亡數(shù)量，并作記錄。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠如出現(xiàn)中毒表現(xiàn)則根據(jù)其癥狀程度記為無中毒、輕度中毒(輕度異常，但無運(yùn)動(dòng)減少、呼吸困難或腹部刺激癥狀) 、明顯中毒(有腹部刺激癥、運(yùn)動(dòng)減少、呼吸困難、眼瞼下垂、腹瀉等，體重通常下降至15～17 g) 、重度中毒(嚴(yán)重腹部刺激癥狀、發(fā)紺、震顫、衰竭、眼瞼下垂、呼吸困難等，體重減輕至＜15g) 和死亡。根據(jù)觀察結(jié)果作出評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 MTT 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

MTT 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。陰性對(duì)照組7 d內(nèi)的生存率為100%，陽性對(duì)照組7 d 內(nèi)細(xì)胞存活率明顯比實(shí)驗(yàn)組要低，其中PLA 為最佳的涂層材料。各浸提液濃度下，各樣品組分別與陰性對(duì)照組兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05) 。細(xì)胞毒性等級(jí)：陰性對(duì)照組0 級(jí); 實(shí)驗(yàn)組1 級(jí); 陽性對(duì)照組1 級(jí)。

圖1 MTT 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 MTT cytotoxicity results

2.2 致敏實(shí)驗(yàn)

3 組通過觀察動(dòng)物在歷經(jīng)皮內(nèi)誘導(dǎo)、局部誘導(dǎo)和全身激發(fā)3 個(gè)階段后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物皮膚反應(yīng)與陰性對(duì)照組相同，未見動(dòng)物出現(xiàn)過敏反應(yīng);陽性對(duì)照組動(dòng)物全部出現(xiàn)過敏反應(yīng)。

2.3 原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)

TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合體浸提液貼敷家兔皮膚未見紅斑，無水腫形成，說明該材料對(duì)家兔皮膚無刺激性(見表2) 。

表2 原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Primary skin irritation test results

2.4 皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)

TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合材料的浸取液背部皮內(nèi)注射后，在24 h、48 h 和72 h 均未發(fā)現(xiàn)局部出現(xiàn)嚴(yán)重皮內(nèi)反應(yīng)，基本為無紅斑或微弱紅斑，少數(shù)有微弱水腫。對(duì)各個(gè)時(shí)間段結(jié)果進(jìn)行記分，計(jì)算出PSI(見表3) ，并計(jì)算出APSI 為0.40。

2.5 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)

TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合材料的浸取液經(jīng)小鼠尾靜脈注射后24 h、48 h、72 h 進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般活動(dòng)良好，生命體征正常，無急性反應(yīng)甚至死亡等發(fā)生(見表4) 。延長觀察時(shí)間至2周，小鼠未見明顯異常。對(duì)照組小鼠同樣無不良反應(yīng)出現(xiàn)。

表3 皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Intracutaneous reactivity test results

表4 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Acute systemic toxicity test results

3 討 論

SA 是一種具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性的天然有機(jī)高分子化合物，能夠作為釋放和包埋RFP 等藥物的載體，并被證實(shí)安全有效［2］。PLA、PLGA 及PCL 是典型的合成類可完全降解的高分子有機(jī)材料，其降解速度還與組織細(xì)胞的生長速度相適應(yīng)，而且降解產(chǎn)物可參加體內(nèi)循環(huán)，最終以CO2和水的形式排出體外，對(duì)機(jī)體和環(huán)境無害，因此具有可靠的生物安全性，并且其具有良好的生物力學(xué)性能及易于加工成形等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于生物醫(yī)用材料中［3］。本研究將上述材料復(fù)合加工并載入抗結(jié)核藥物RFP，制作成交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合體，其呈多孔結(jié)構(gòu)、大小均勻、排列有序，有較低的結(jié)晶度，在體內(nèi)更易降解，該材料具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性?？紤]人工骨復(fù)合材料屬于置入性生物材料，在體內(nèi)存留時(shí)間長，所用材料的安全性如何，是否對(duì)人體具有毒性、致癌致病性、致畸性或其他潛在危害，是必須關(guān)注的問題。一種醫(yī)用材料在正式投入生物體研究或臨床應(yīng)用前，必須依照國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［4］，對(duì)其進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。

生物安全性評(píng)價(jià)包括體外測試和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。前者一般是以材料的浸提液為對(duì)象，測試其對(duì)組織細(xì)胞增殖、生長、分化等活動(dòng)的影響，以MTT 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)為代表［5］。這一方法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測，目前己成為生物材料和醫(yī)療器械生物評(píng)價(jià)體系中最重要的指標(biāo)之一，它能在短期內(nèi)檢出受試品對(duì)細(xì)胞新陳代謝的影響，對(duì)毒性物質(zhì)有較高的敏感性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括致敏實(shí)驗(yàn)、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、急性全身毒性實(shí)驗(yàn)等，其中原發(fā)性皮膚刺激、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)可評(píng)價(jià)復(fù)合材料中可濾過性物質(zhì)的毒性作用。由于生物材料中許多雜質(zhì)對(duì)免疫系統(tǒng)的干擾劑量常低于其中毒劑量，這些實(shí)驗(yàn)在雜質(zhì)含量低、中毒癥狀不出現(xiàn)之前就可以誘出免疫反應(yīng)癥狀。致敏實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)復(fù)合材料中是否具有潛在過敏原。急性全身毒性實(shí)驗(yàn)是常選的生物學(xué)性能測試方法之一，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織和我國國家標(biāo)準(zhǔn)［4-5］(GB16175) 都規(guī)定了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組7 d 生存率較陰性對(duì)照組稍低，但明顯高于陽性對(duì)照組，由此可以得出TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 復(fù)合體具有良好的的生物相容性，說明復(fù)合材料中除RFP 外的主體物質(zhì)及輔料(如固化液等) 成分無毒性，并且通過材料合成后甚至能夠降低RFP 所產(chǎn)生的毒性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)材料無毒性，無致敏性。

因此，交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨TPB/SA-RFP/PLA(PLGA、PCL) 無MTT 細(xì)胞毒性，細(xì)胞相容性良好，并能夠降低RFP 直接給藥的生物毒性，不引起全身毒性反應(yīng)、皮膚/皮內(nèi)刺激反應(yīng)和急性過敏反應(yīng)。

［1］伍衛(wèi)剛，鄭啟新，郭曉冬.利福平-異煙肼-控釋型載藥人工骨的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2010，1(1) ：137-143.

［2］肖海軍，薛鋒，何志敏，等.納米羥基磷灰石/羧甲基殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合骨水泥的性能［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(38) ：7113-7117.

［3］季航宇，潘功茂，謝友揚(yáng)，等.影像學(xué)測量鎖骨與周圍血管毗鄰關(guān)系：置釘?shù)陌踩珔^(qū)和危險(xiǎn)區(qū)［J］.中國組織工程研究，2012，16(9) ：1593-1596.

［4］中國標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室.GB/T16175-1996 醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：9-16.

［5］Srivastava S，Gorham SD，Courtney JM.Screening of in vitro cytotoxicity by the adhesive film test［J］.Biomaterials，1990，11(2) ：133-137.