端粒酶測定在肺癌診斷中的臨床意義

馮海英 孫海波 韓云峰

1.齊齊哈爾醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院骨外三科，黑龍江齊齊哈爾 161006

腫瘤細胞生長通常需要端粒酶的存在，其是目前發(fā)現(xiàn)的廣譜腫瘤標志。有研究報道，多數(shù)肺癌細胞中均有端粒酶的激活。端粒酶是核糖核蛋白復合物，由蛋白質和RNA組成，具有逆轉錄酶活性[1-2]。腫瘤細胞區(qū)別于正常細胞主要為癌細胞永生化，研究表明，激活端粒酶基因與腫瘤細胞永生化存在密切關系[3]。關于多項聯(lián)合檢測肺癌患者端粒酶在肺癌中的臨床意義，目前還沒有報道。本研究分析了2009年1月～2010年12月期間我院收治的經(jīng)確診為肺癌合并胸水患者36例誘導痰、外周血、胸水、支氣管沖洗液、纖維支氣管鏡活檢組織的端粒酶活性，探討端粒酶作為肺癌診斷標志物的臨床價值，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月～2010年12月間我院收治的經(jīng)確診為肺癌合并胸水的患者36例的臨床資料作為研究組，所有患者經(jīng)纖維支氣管鏡檢查，發(fā)現(xiàn)病變肺組織后鉗取3～5塊組織，離體后30 min內(nèi)放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。標本進行病理學及組織細胞學檢查，明確診斷為肺癌。36例患者中，男25 例，女 12 例；年齡 31～80 歲，平均（62.3±19.4）歲；主要臨床表現(xiàn)：咳嗽28例，咯血26例，聲音嘶啞10例，胸痛14例，發(fā)熱21例，胸悶氣短15例；病理分型：鱗癌19例（52.8%），小細胞癌4例（11.1%），腺癌10例（27.8%），未定型癌（腺鱗癌、復合性癌）3例（8.3%）。另選擇35例同期經(jīng)確診肺部良性病變伴胸水患者作為對照組，其中，男24例，女11例；年齡 32～79 歲，平均（61.5±18.2）歲。兩組年齡、性別等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 Taq DNA聚合酶購自天象人生物工程公司，批號：02045674；AgNO3為北京化工廠產(chǎn)品，批號：111026；考馬斯亮藍G-250購自南京建成生物工程公司，批號：20110912；端粒酶檢測試劑盒購自Onco Inc公司，批號：1104101。所有實驗步驟均嚴格按藥盒說明書操作。

1.2.2 誘導痰的采集 收集患者痰液3～5 mL放入無菌杯中，用無菌生理鹽水洗滌兩遍，加入等量的1 moL/L NaOH溶液，放入4℃冰箱24 h，取溶解痰液高速離心，將沉淀細胞放入-80℃冰箱備用。檢測時，將冷凍的標本解凍后放入200μL的端粒酶裂解液中離心，移取上清液放入EP管中待測[4]。

表1 兩組患者各指標端粒酶活性比較（x±s）

1.2.3 胸水細胞提取液的采集 各組患者胸腔穿刺術抽取新鮮胸水100 mL，高速離心，棄上清，離心細胞置液氮中保存（-196℃）。檢測時，將冷凍的標本解凍后放入200μL的端粒酶裂解液中離心后移取上清液放入EP管中待測。

1.2.4 患者血細胞制備 抽取外周血5 mL，用肝素抗凝，血樣經(jīng)Ficoll分離液離心后，收集界面細胞，生理鹽水洗滌1次，放入0.2 mL PBS中，將標本放在-20℃冰箱中保存[5]。

1.2.5 支氣管灌洗液收集 氣管鏡頂端插入肺段或亞段支氣管開口處，從活檢孔用無菌生理鹽水100 mL分5次注入，每次注入后立即在6.5～25.5 kPa的負壓下吸出，回收液量40%～60%；雙層紗布過濾后，離心放-80℃冰箱凍存[6]。

1.2.6 肺組織采集 采用電子纖維支氣管鏡活檢患者時取肺組織，用PBS液沖洗后，液氮速凍放在-80℃保存。檢測時取冰凍組織，剪碎，放入100μL細胞裂解液，水浴30 min，高速離心，收集上清液，放在-80℃冰箱中保存[7]。

1.2.7 TRAP-ELISA法測定端粒酶活性 取各種標本的細胞[（1×105）～（1×106）]加 150 μL 裂解液抽提端粒酶，離心后取上清2μL做反應模板；取TRAP反應管，各加入45μL反應混合物行端粒酶重復序列擴增 （TRAP），并與已處理的標本2 μL混勻，加入30μL液體石蠟，離心后置25℃水浴保存30 min，取出即行 PCR 循環(huán)擴增：94℃ 30 s，55℃ 30 s；共行 35個循環(huán)。結果判定：酶標儀波長450 nm/690 nm，端粒酶活性為△A=A450-A690。敏感性（陽性率）=測定指標的陽性例數(shù)/總例數(shù)。準確性=（真陽性數(shù)+真陰性數(shù)）/研究總例數(shù)。特異性=對照組測定指標的陰性例數(shù)/對照組的總例數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者各指標端粒酶活性的比較

研究表明，與對照組患者比較，研究組患者誘導痰性、外周血、胸水、支氣管沖洗液、纖維支氣管鏡活檢組織中端粒酶活性明顯增高，兩組患者比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 見表 1。

2.2 多項指標端粒酶活性檢測診斷肺癌的特異性、敏感性及準確性比較

5種標本聯(lián)合檢測的結果判斷：5種標本檢測均為陰性即判斷為陰性，其中，有1種以上檢測為陽性即判斷為陽性。標本單獨檢測與聯(lián)合檢測敏感性、特異性和準確性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。五種標本中端粒酶活性聯(lián)合及單獨檢測對肺癌的診斷敏感性、特異性和準確性情況見表2。

表2 多項指標端粒酶活性檢測診斷肺癌的特異性、敏活性及準確性比較[%（n1/n2）]

3 討論

端粒是染色體末端存在的獨特重復片段特殊結構，在染色體定位、染色體保護、染色體復制控制細胞的生長方面起著控制的作用。當細胞發(fā)生分裂時，端粒片段出現(xiàn)縮短，促使細胞凋亡和導致程序性死亡[8]。端粒的長度又被稱為是“有絲分裂鐘”，而端粒酶作為一種逆轉錄酶可以用自身RNA為模板，在端粒DNA的3'末端，以逆轉錄方式延伸，修補細胞分裂時端粒的縮短，穩(wěn)定端粒長度，導致細胞永生化，不斷增殖和不死亡[9-10]，從而導致惡性變，所以端粒酶可以作為較廣譜的腫瘤標志物。

本研究表明，與對照組患者比較，研究組患者誘導痰、外周血、胸水、支氣管沖洗液、纖維支氣管鏡活檢組織中端粒酶活性明顯增高，兩組患者相對應指標比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在肺癌患者中，各類標本均顯示端粒酶高表達，端粒酶逆轉錄酶基因的抑制，導致那些具有顯著基因改變、脫離細胞周期、已失去端粒保護的細胞繼續(xù)生長，因此，端粒酶活性檢測可用于肺癌的診斷，是臨床診斷手段的重要補充，有助于提高肺癌診斷的靈敏度及準確性[11]。本研究結果顯示，聯(lián)合5種標本中端粒酶活性的檢測對肺癌的診斷敏感性、特異性和準確性與單獨檢測比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），聯(lián)合檢測誘導痰、胸水、外周血、支氣管沖洗液、纖維支氣管鏡活檢組織端粒酶活性對肺癌的診斷敏感性、特異性和準確性均較單項檢測大大提高，特別是對肺癌伴胸水患者聯(lián)合檢測的早期診斷有重要意義。

綜上所述，應用PCR方法檢測端粒酶活性診斷肺癌敏感性高，特異性強，提高了診斷準確率。作為腫瘤標志物的端粒酶，在篩選肺癌高危人群、定期監(jiān)測中可能具有重要臨床指導意義。

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