豬偽狂犬病病毒間接ELISA 檢測方法的建立

折尕才措

（青海省玉樹州畜牧獸醫(yī)工作站，青海玉樹 815000）

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以發(fā)熱、腦脊髓炎、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征，臨床上表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎；新生仔豬發(fā)熱、神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡，死亡率可達(dá)100%；成年豬多耐過而呈隱性感染，并成為該病的主要傳染源［1－4］。該病在世界范圍內(nèi)流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5－7］，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國也將其列為二類動(dòng)物疫病。我國自1947年發(fā)現(xiàn)此病以來，現(xiàn)全國已有30多個(gè)省份發(fā)生流行，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一［8－10］。為預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行，需加強(qiáng)PR診斷技術(shù)的研究與推廣工作。本研究以純化的全病毒抗原為包被抗原，優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立了可檢測PR血清抗體的間接ELISA診斷方法，并對(duì)現(xiàn)地采集的豬血清進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞、血清 豬偽狂犬病病毒SA株、倉鼠腎細(xì)胞（BHK－21）由本實(shí)驗(yàn)室保存；CSFV、PCV－2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV參考陽性血清及PRV參考陰性、陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 HRP標(biāo)記的SPA購自武漢博士德生物工程有限公司；可溶型單組分TMB底物溶液購自天根生化科技（北京）有限公司；BSA、小牛血清，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PRV抗原制備 將PRV接種于BHK－21單層細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)典型的病變后，收獲病毒，反復(fù)凍融3次，以高速冷凍離心機(jī)8 000r／min離心30 min，取離心上清液以超速冷凍離心機(jī)35 000r／min離心120min，沉淀充分溶解于適量0.01mol／L PBS液中，35 000r／min再次離心120min。取少許0.01mol／L PBS液溶解沉淀，低速離心取上清即為PRV抗原，測定抗原濃度后，冷凍保存。

1.2.2 PRV間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.2.1 抗原最適包被濃度和待檢血清最佳稀釋濃度的確定 采用方陣滴定法，根據(jù)陽性血清、陰性血清的P／N值，確定抗原的包被濃度和血清的稀釋倍數(shù)。

1.2.2.2 最佳封閉液及封閉時(shí)間的確定 用100 mL／L小牛血清、50g／L脫脂奶粉、10g／L BSA、10 g／L明膠、PBST 5種不同封閉液分別封閉30、60、90、120、150min，按常規(guī)ELISA操作方法進(jìn)行試驗(yàn)操作，確定最佳的封閉液及封閉時(shí)間。

1.2.2.3 待檢血清及底物最佳作用時(shí)間的確定在相同的試驗(yàn)條件下，待檢血清分別作用30、60、90、120min，底物分別作用5、10、15、20、25min，確定最佳的待檢血清及底物作用時(shí)間。

1.2.2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 選用北京世紀(jì)元亨的PRV ELISA檢測試劑盒檢測過的40份陰性血清樣品，用所建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測，測定OD 450nm值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出40份血清樣本平均OD 450nm值和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式（平均OD 450nm值＋3×SD）計(jì)算其判定標(biāo)準(zhǔn)的臨界值。

1.2.3 血清交叉反應(yīng)試驗(yàn) 用建立的ELISA方法測定已知陽性的 PRV、CSFV、PCV－2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV參考血清，確定血清交叉反應(yīng)情況。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇4位操作者分別對(duì)PRV參考陽性和參考陰性血清于不同地方進(jìn)行間接ELISA檢測，比較不同操作者之間的結(jié)果差異。

1.2.5 比較性試驗(yàn) 將不同豬場送檢的420份血清用北京世紀(jì)元亨的PRV ELISA試劑盒和本研究建立的間接ELISA方法同時(shí)檢測，計(jì)算兩者的符合率。

1.2.6 ELISA方法的應(yīng)用 利用建立的ELISA方法，對(duì)山東地區(qū)送檢的615份血清樣品進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)血清陽性率。

2 結(jié)果

2.1 PRV抗原的制備

經(jīng)差速離心提取的PRV抗原紫外吸收法測定，其濃度為1.604mg／mL。

2.2 ELISA最適反應(yīng)條件確定

2.2.1 最適抗原包被濃度和血清稀釋度的確定根據(jù)檢測結(jié)果確定抗原的最佳包被濃度為1∶2 000倍稀釋（0.802μg／mL），血清的最佳稀釋度為1∶100（表1）。

表1 血清稀釋倍數(shù)與抗原包被濃度的確定Table 1 Optimization of serum concentration and antigen concentration

2.2.2 最佳封閉液及封閉時(shí)間的確定 采用10g／L BSA封閉90min，P／N值最高，因此確定最佳封閉液為10g／L BSA，最佳封閉時(shí)間為90min（表2）。

2.2.3 待檢血清與底物最佳作用時(shí)間的確定 結(jié)果見表3、表4。由表3可見，待檢血清作用60min時(shí)，陽性血清OD 450nm值≈1.0，陰性血清OD450nm值＜0.2，且P／N值最高；由表4可見，底物作用15min時(shí)，陽性血清OD 450nm值≈1.0，陰性血清OD450nm值＜0.2，P／N值較高；因此，確定待檢血清的最佳作用時(shí)間為60min，底物最佳作用時(shí)間為15min。

表2 最佳封閉液與最佳封閉時(shí)間的確定Table 2 Optimization of blocking solution and reaction time

表3 血清作用時(shí)間的確定Table 3 Optimization of serum reaction time

2.2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 對(duì)40份用北京世紀(jì)元亨的PRV ELISA試劑盒檢測出的陰性血清用建立的間接ELSIA方法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出血清樣本平均OD 450nm值為0.174，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.061，以樣本的平均 OD 450nm值＋3×SD＝0.357為臨界值。將待測樣本OD 450nm值≥0.357判為陽性，介于0.357～0.296（樣本的平均OD 450nm值＋2×SD）為疑似，小于0.296判為陰性。

2.3 血清交叉反應(yīng)試驗(yàn)

用已知陽性的 PRV、CSFV、PCV－2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV參考血清進(jìn)行ELISA交叉反應(yīng)，除PRV陽性血清呈陽性外，其他6種血清OD450nm值均小于0.296，證明無血清學(xué)交叉反應(yīng)（表6）。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

4位操作者對(duì)PRV參考陽性血清檢測變異系數(shù)為5.50%，PRV參考陰性血清檢測結(jié)果變異系數(shù)為7.17%，均小于8%（表7），結(jié)果無顯著差異，說明建立的間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表4 底物顯色時(shí)間的確定Table 4 Optimization of substrate reaction time

表5 陰性血清樣品OD 450nm值Table 5 OD 450nm value of negative serum samples

表6 血清交叉反應(yīng)試驗(yàn)Table 6 Test of serum cross－reaction

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 7 The test of stability

2.5 比較性試驗(yàn)

將不同豬場送檢的420份血清用北京世紀(jì)元亨的PRV ELISA試劑盒和本研究建立的間接ELISA同時(shí)檢測，北京世紀(jì)元亨ELISA試劑盒檢測出陽性樣品186份，本研究建立的PRV ELISA方法檢測出陽性樣品162份，敏感性為87.1%（162／186）；北京世紀(jì)元亨ELISA試劑盒檢測出陰性樣品234份，本研究建立的PRV ELISA方法檢測出陰性樣品216份，特異性為92.3%（216／234）。兩種方法的符合率為90.0%（378／420）。

2.6 PRV間接ELISA方法的應(yīng)用

用建立的間接ELISA方法檢測山東等各地送檢的不同豬場的615份疑似PRV感染血清樣本，檢出陽性樣品520份，陽性率為84.6%。

3 討論

豬偽狂犬的診斷方法較多，主要包括病毒分離與鑒定、血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測方法［11］。其中，血清學(xué)檢測方法是檢測PRV血清抗體的重要手段之一，在PRV感染早期檢測、流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測等方面發(fā)揮著重要的作用，也是免疫豬群抗體水平監(jiān)測的主要方法。對(duì)于PRV血清學(xué)診斷，病毒中和試驗(yàn)是最經(jīng)典、使用最廣泛的診斷方法。病毒中和試驗(yàn)雖然準(zhǔn)確性高，但存在試驗(yàn)周期長、操作繁瑣和不適于大批量樣品檢測等缺點(diǎn)。ELISA檢測方法具有敏感性和特異性強(qiáng)、操作簡單、檢測快速、高通量、無輻射、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，是當(dāng)前動(dòng)物傳染病檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和免疫監(jiān)測廣泛采用的血清學(xué)診斷技術(shù)。本研究以純化的全病毒抗原作為包被抗原建立的間接ELISA診斷方法檢測常見6種豬病的陽性血清均為陰性，顯示出了良好的特異性；4位操作者檢測的變異系數(shù)均小于8%，顯示出了良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性；在符合性試驗(yàn)中本研究建立的PRV間接ELISA相對(duì)于北京世紀(jì)元亨ELISA試劑盒 的 符 合 率 為 90.0% （378／420）、敏 感 性 為87.1%（162／186）、特異性為92.3%（216／234）。造成這一現(xiàn)象的主要原因可能是兩種方法所用的抗原純度不同，雖然北京世紀(jì)元亨ELISA試劑盒和本研究的PRV間接ELISA診斷方法均采用全病毒作為抗原，但全病毒由于受純化方面的限制，純化效果較差，往往導(dǎo)致試驗(yàn)的背景值偏高。在PRV間接ELISA與北京世紀(jì)元亨ELISA試劑盒共同檢測的420份血清樣品中商品化試劑盒檢測出陽性186份，陰性234份；PRV間接ELISA檢出陽性180份，陰性240份。以上說明本研究的PRV間接ELISA診斷方法可較北京世紀(jì)元亨ELISA試劑盒進(jìn)一步減少非特異性反應(yīng)，盡可能的避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，這在進(jìn)出口檢疫中具有明顯的優(yōu)勢(shì)?？傊?，本研究建立PRV ELISA方法檢測具有較好的敏感性、特異性、重復(fù)性與穩(wěn)定性，顯示出了良好的應(yīng)用前景，本實(shí)驗(yàn)室預(yù)期將其組裝成試劑盒，為我國PRV疫苗免疫水平抗體監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡便、快速的血清學(xué)檢測方法。

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