口服枸杞多糖對實驗性食管癌大鼠免疫功能影響的研究

楊書良，郝玉栓＊，單鐵英，胡素紅

（1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲056029；2.邯鋼職工醫(yī)院）

枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）作為枸杞子的主要活性成分已日益得到臨床醫(yī)生的高度重視。研究表明，LBP有增強機體的免疫功能和顯著的抗腫瘤效應(yīng)，它能從調(diào)動機體自身的抗病能力出發(fā)，在提高機體免疫力的同時殺傷腫瘤細(xì)胞［1］；它能促進骨髓有核細(xì)胞數(shù)和粒／巨噬細(xì)胞集落數(shù)量的增加（CFU－GM）；它還能誘導(dǎo)體內(nèi)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而這些因子均有促進免疫活性細(xì)胞增殖、分化和成熟的作用。所以臨床上普遍認(rèn)為LBP有較強的免疫活性，是有效的免疫增強劑，在細(xì)胞免疫和體液免疫中具有十分重要作用［2］。LBP的抗腫瘤作用是否與機體在腫瘤發(fā)生過程中，免疫效應(yīng)細(xì)胞（如CD4＋T，CD8＋T）和細(xì)胞因子（如IL－2、IL－10）增減有關(guān)，目前報道較少。本研究以NMBA誘導(dǎo)大鼠食管癌為對象，觀察LBP在誘癌過程中對CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞和血清IL－2、IL－10水平的影響，探討其防癌、抗癌作用的免疫學(xué)機制，為進一步開發(fā)免疫增強劑的抗腫瘤藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5～6周齡清潔級健康雄性F－344大鼠96只，購于上海斯萊克實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器 LBP由華北制藥集團新藥研究開發(fā)中心分離純化，純度＞90%。NMBA（Osaka，Japan），純度 ＞98%。IL－2ELISA 試 劑 盒、IL－10 ELISA試劑盒（ADL）。小鼠抗大鼠CD4－FITC單抗（Caltag）。小鼠抗大鼠CD8－PE單抗（BD）。流式細(xì) 胞 儀 （FACS Vantage，Becton Dickin Son）。SCR20B型低溫高速離心機（日本HITACHI公司）。－80℃超低溫冰箱（SANYO）。雙目光學(xué)顯微鏡、顯微照像機（Olympus）。切片機（Leica）。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗 大鼠恒溫（22～25℃）、恒濕（40～60%），滅菌飼料飼養(yǎng)。兩周后隨機將大鼠分為對照組、LBP組、NMBA誘癌組和誘癌＋LBP組，每組24只。對照組大鼠生理鹽水灌胃5ml／kg／次／日；LBP組大鼠 LBP灌胃5ml／10mg／kg／次／日；NMBA誘癌組大鼠每周3次皮下注射NMBA（0.5 mg／kg／次）；誘癌＋LBP組大鼠在每周3次皮下注射 NMBA（0.5mg／kg／次）的同時LBP灌胃5ml／10mg／kg／次／日，所有大鼠用藥時間共6周。分別在第6、12和18周時從各組大鼠中取8只麻醉后解剖，取食管進行病理學(xué)觀察；采外周血做CD4＋和CD8＋T細(xì)胞數(shù)，ELISA檢測技術(shù)檢測血清IL－2、IL－10水平。

1.3.2 病理學(xué)觀察 將大鼠食管縱行剖開平鋪，肉眼觀察食管癌前病變發(fā)生情況，并對發(fā)生瘤體測量大小和計數(shù)；取食管黏膜，常規(guī)石蠟包埋、制片，HE染色，在雙盲情況下光鏡觀察。

1.3.3 外周血CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞檢測 取不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體各10μl，分別加入100μl肝素抗凝的全血，室溫下孵育15min，加入紅細(xì)胞裂解液，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測。測定5000個細(xì)胞，記錄CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞分別占淋巴細(xì)胞的百分比。

1.3.4 血清IL－2、IL－10含量檢測 按照說明書測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

實驗期間各組大鼠體重呈正常生理性增長，各組間平均體重變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第4周后，誘癌組大鼠出現(xiàn)皮毛蓬松，活動減少，弓背卷縮現(xiàn)象，但體重仍在增長。

2.2 病理變化

對照組、LBP組大鼠各時間點肉眼觀察，食管黏膜光滑，色澤正常，未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長；誘癌組大鼠食管黏膜出現(xiàn)肉眼可見的多發(fā)或單發(fā)的隆起性病變（最大徑≥1mm為標(biāo)準(zhǔn)）。鏡下觀察對照組、LBP組大鼠食管黏膜上皮細(xì)胞無異常表現(xiàn)；誘癌組大鼠食管黏膜上皮表現(xiàn)為基底層細(xì)胞大小不一、核漿比例失調(diào)、核染色加深、核膜增厚等上皮內(nèi)瘤變表現(xiàn)（以Ⅲ級為計算標(biāo)準(zhǔn)）；誘癌＋LBP組大鼠食管黏膜上皮細(xì)胞變化明顯減輕（表1）。實驗結(jié)果充分說明NMBA誘發(fā)大鼠食管模型可靠，LBP對食管黏膜癌變的發(fā)生有一定的抑制作用。

2.3 外周血CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞

各組測定結(jié)果見表2。

2.4 血清IL水平

見表3。

表1 不同組別大鼠食管腫瘤發(fā)生率和食管黏膜上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級發(fā)生率（%，n＝8）

表2 不同組別大鼠外周血CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞（%，n＝8，x—±s）

表3 不同組別大鼠血清IL－2、IL－10水平（pg／ml，n＝8，x—±s）

3 討論

傳統(tǒng)中草藥以低毒、價廉、有效、易于接受等優(yōu)點在腫瘤防治研究領(lǐng)域越來越受到人們的關(guān)注［3］。枸杞子性平、味甘，具有滋補肝腎、益精明目的功效，LBP是枸杞子經(jīng)脫脂、水提、反復(fù)醇析所得。LBP具有較強的免疫活性，是有效的免疫增強劑，在細(xì)胞免疫和體液免疫中具有十分重要作用［4］。本研究以NMBA誘發(fā)食管癌大鼠為實驗?zāi)Ｐ?，探討LBP在其誘癌過程中抗腫瘤作用的免疫學(xué)機制，為開發(fā)以免疫增強劑為主的防治腫瘤藥物提供參考。

外周血CD4＋、CD8＋T細(xì)胞數(shù)量的多少及血清細(xì)胞因子水平的高低，可直接反映出機體的免疫狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中CD4＋、CD8＋T細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致機體抗腫瘤免疫反應(yīng)降低，最終發(fā)生腫瘤。LBP作為一種“植物疫苗”進入腸道后，可通過抗原遞呈細(xì)胞上的“MHC－肽”與T細(xì)胞受體（TCR）聚合。CD4或CD8的存在可穩(wěn)定TCR和MHC－肽之間的相互作用可使免疫受體酪氨酸激活基序 （ITAM）發(fā) 生 磷 酸 化 從 而 激 活 T 細(xì) 胞［5－8］。CD4＋T細(xì)胞是一群具有調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能的細(xì)胞，他們的分化受許多因素的影響，其中最重要的因素就是細(xì)胞因子。IL－2在機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位，IL－2能促進外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF，從而增強抗腫瘤的作用。由于IL－2的含量與機體的免疫功能相關(guān)，尤其是與細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)，因此可將IL－2的產(chǎn)生作為細(xì)胞免疫效應(yīng)的主要指標(biāo)。靜止的自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）表達IL－2受體的β鏈，一種70kDa的中等親和力受體，IL－2可直接將其激活，NK細(xì)胞激活后能釋放γ干擾素（IFNγ）和其他細(xì)胞因子殺傷瘤細(xì)胞［9－11］。所有這些細(xì)胞都能對IL－2產(chǎn)生反應(yīng)，獲得非特異細(xì)胞毒功能，這些細(xì)胞統(tǒng)稱為淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞（LAK細(xì)胞）。LAK細(xì)胞與NK細(xì)胞相比，它不但能殺傷新鮮的腫瘤細(xì)胞，而且對許多不同譜系的腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用。本研究顯示，LBP具有增加外周血CD4＋、CD8＋T細(xì)胞和增加細(xì)胞因子IL－2的分泌的作用，可形成較強的免疫活性，是有效的免疫增強劑，在細(xì)胞免疫和體液免疫中具有十分重要作用。

人體腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫功能的改變有著密切的關(guān)系，由于機體免疫監(jiān)視的缺陷，導(dǎo)致免疫逃逸的發(fā)生，使腫瘤發(fā)生率增高。腫瘤發(fā)生時腫瘤細(xì)胞本身也可分泌IL－10，IL－10通過抑制單核／巨噬細(xì)胞、Th細(xì)胞、CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞等來抑制機體對腫瘤的免疫作用，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生逃逸現(xiàn)象。在惡性腫瘤病人中血清IL－10大多數(shù)情況下是增高的，且IL－10的高低與腫瘤病人的治療效應(yīng)和病情相關(guān)，血清IL－10增高的腫瘤患者在經(jīng)手術(shù)或化療后明顯下降［13－15］。本研究顯示，誘癌組大鼠血清IL－10水平在第6周明顯升高，隨著時間的推移雖然有所下降，但下降并不明顯。誘癌＋LBP組大鼠血清中IL－10水平明顯低于誘癌組大鼠，但高于對照組和LBP組。12周前血清IL－10水平顯著下降，12周下降不明顯，與誘癌組各時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但與對照組各時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果說明NMBA誘癌過程中，大鼠的抗腫瘤免疫狀態(tài)是受抑制的，血清IL－10水平可反映出腫瘤患者抗腫瘤免疫狀態(tài)。

［1］王曉華，單鐵英，侯永超et al.枸杞多糖增強效應(yīng)T細(xì)胞增殖和殺瘤活性機制的研究［J］.中國實驗診斷學(xué)，2010，14（5）：699.

［2］許忠新，單鐵英，蘇安英et al.枸杞多糖對人外周血巨噬細(xì)胞活性的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010；39（16）：2177.

［3］李海波，梅之南，朱 帆.枸杞多糖抗腫瘤作用免疫學(xué)機理的探討［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005；25（2）：115.

［4］陶大勇.枸杞多糖的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（22）：6816.

［5］Seder RA，Ahmed R.Similarities and differences in CD4＋and CD8＋effector and memory T cells generation［J］.N at Imm unol Rev，2003，4（9）：835.

［6］Wang R，Epstein J，Charoenvit Y et al.Induction in humans of CD8＋and CD4＋T cell and antibody responses by sequential immunization with malaria DNA and recombinant protein［J］.Immunol，2004，172（2）：5561.

［7］Lee BN，F(xiàn)ollenM，Shen DY，et al.Dep ressed type 1cytokine synthesis by superantigen－activated CD4＋T cells of women with human pap illomavirus－related high－grade squamous intraep ithelial lesions［J］.Clin D iag Lab Imm unol，2004，11（2）：239.

［8］Diederichsen AC，Hjelmborg JB，Christensen PB，et al.Prognostic value of the CD4＋／CD8＋ratio of the tumour infiltrating lymphocytes in colorectal cancer and HLA－DR expression on tumour cells［J］.Cancer Immunol Immunother，2003，52（7）：423.

［9］宋 丁，王燕云.CD8＋CD28—T細(xì)胞在原發(fā)性肝癌患者外周血的表達及意義［J］.中國實驗診斷學(xué)，2009，13（4）：493.

［10］徐文蓮，李秀珍，李 捷.IgA腎病患者扁桃體切除前后血、尿IL－2、IL－6的變化［J］.中國實驗診斷學(xué)，2010，14（7）：1087.

［11］Zimmerli SC，HarariA，Cellerai C，et al.H IV－1－specific IFN－γ／IL－2－secreting CD8Tcells support CD4－independent p roliferation of H IV－1－specific CD8Tcells［J］.ProcN atlAcad SciUSA，2005，102（20）：7239.

［12］姜 燕，呂昌龍.口服Ag85A脂質(zhì)體DNA誘導(dǎo)T細(xì)胞亞群應(yīng)答效應(yīng)研究［J］.中國免疫學(xué)雜志，2009，25（10）：883.

［13］歐陽杰，張金龍，李方都，et al.消化道腫瘤化療病人血清IL－10水平的初步探討［J］.放射免疫學(xué)雜志，2007，20（1）：77.

［14］Staples KJ，Bergmann M，Barnes PJ，Newton R.Stimulus－specific inhibition of IL－5by cAMP－elevating agents and IL－10reveals differential mechanisms of action［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，273：811.

［15］齊法蓮，徐 軍，武翠華，et al.慢性腎衰患者血清 L－18.IL－10.SL－2R、TNF－a水平變化［J］.放射免疫學(xué)雜志，2006，19（3）：178.