地黃飲子對海馬神經(jīng)元缺氧損傷的保護機制

李子軍， 劉春娜

（遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

地黃飲子對海馬神經(jīng)元缺氧損傷的保護機制

李子軍， 劉春娜*

（遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

目的 觀察地黃飲子 （熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉等）對缺血缺氧損傷海馬神經(jīng)細胞的保護作用并探討機制。方法 將培養(yǎng)細胞分為對照組、模型組及藥物保護組；其中，損傷組采用Na2S2O41 mmol/L加低糖作用3 h；藥物保護組在加入損傷因素同時加入不同濃度含地黃飲子血清。通過比色法測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶含有量（LDH），采用MTT法測定腦海馬神經(jīng)細胞存活率，利用線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶 （SDH）含有量來分析地黃飲子的保護作用及其作用的有效濃度；測定缺血缺氧損傷下海馬神經(jīng)細胞內(nèi)超氧化物歧化酶 （SOD）與丙二醛 （MDA）含有量。結(jié)果 含地黃飲子血清與空白血清比例在1∶3～3∶1之間，均對缺氧神經(jīng)細胞具有保護作用。降低損傷細胞LDH釋放，細胞膜損傷程度減輕。MTT值不同程度升高，提示細胞活力狀態(tài)提高、細胞能量代謝過程有所改善；地黃飲子可以保護缺血缺氧環(huán)境中海馬神經(jīng)細胞內(nèi)SOD的活力，降低MDA的含有量，而且隨劑量的增加而增加。結(jié)論地黃飲子對缺氧損傷腦海馬神經(jīng)細胞有明顯保護作用；其作用機制可能與降低氧自由基損傷有關(guān)。

地黃飲子；海馬神經(jīng)細胞；缺血缺氧；氧自由基

地黃飲子出自金元四大家之首劉完素的《黃帝素問宣明論方》，用于治療下元虛衰，痰濁上泛，壅塞竅道的暗痱證［1］。目前地黃飲子對神經(jīng)細胞缺血、缺氧損傷的保護作用已有報道，但是具體機制目前仍不明確。本實驗通過觀察其對急性缺氧損傷腦海馬神經(jīng)細胞的保護作用，在細胞水平闡述地黃飲子的抗缺血、氧損傷作用并探討可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 新生24 h的SD乳鼠、Wistar大鼠 （遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗動物中心提供）。

1.2 藥品和試劑 地黃飲子 （方藥組成：熟地黃12 g，巴戟天9 g，山茱萸9 g，石斛9 g，肉蓯蓉9 g，附子6 g，五味子6 g，官桂6 g，白茯苓6 g，麥門冬6 g，石菖蒲6 g，遠志6 g，生姜5片，大棗1枚，薄荷5～7片。購自遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科）；DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基 （GIBCo公司），多聚賴氨酸、胰蛋白酶 （Sigma公司），胎牛血清、馬血清 （北京華美生物工程公司）。

1.3 含藥血清的制備 將地黃飲子藥材浸于10倍量常水中過夜，加熱煮沸1 h，藥渣再加入8倍量的常水煮沸45 min，將藥液濃縮，使其質(zhì)量濃度為1 g生藥/mL，于4℃冰箱保存。Wistar大鼠，體質(zhì)量 （250±20）g，10只，雌雄各半，晚禁食，灌服藥液 （劑量按1 g生藥/100 g大鼠），連續(xù)3 d，2次/d，于第3天給藥后1 h用水合氯醛麻醉動物 （劑量為3.5 mL/kg），從股動脈取血，自然分離血清，56℃水浴中滅活30 min，0.22 μm濾器過濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆?。設(shè)空白組血清制備時灌服生理鹽水，余方法同上。

2 實驗方法

根據(jù)張挺［2］、任歷［3］等的方法加以改進，以連二亞硫酸鈉Na2S2O4藥物制造急性缺氧模型，并以此為基礎(chǔ)進行實驗。

2.1 藥物實驗分組 正常對照組：使用正常細胞培養(yǎng)液和空白血清混合培養(yǎng)；損傷對照組：使用含有Na2S2O4的缺氧培養(yǎng)液和空白血清混合培養(yǎng)；藥物保護組：使用含有Na2S2O4的缺氧培養(yǎng)液和不同濃度的含藥血清混合培養(yǎng) （含藥血清用空白血清稀釋成不同比例），具體如下：

藥物保護Ⅰ組：藥物血清與空白血清比例為1∶3；藥物保護Ⅱ組：藥物血清與空白血清比例為1∶1；藥物保護Ⅲ組：藥物血清與空白血清比例為2∶1；藥物保護Ⅳ組：藥物血清與空白血清比例為3∶1。

2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察 使用HE染色處理后對海馬神經(jīng)細胞突觸的生長狀態(tài)，細胞輪廓，胞體暈光等進行觀察。用來對模型的效果進行鑒定，觀察在藥物保護下細胞的變化。

2.3 乳酸脫氫酶 （LDH）漏出量測定 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)過測定，計算各組腦海馬細胞培養(yǎng)上清液中所含LDH漏出量。反映在藥物保護作用下神經(jīng)細胞的變化。

2.4 腦海馬神經(jīng)細胞存活率和細胞活力測定 使用96孔細胞培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)，施加處理因素，測定570 nm波長處各組各孔的吸光度 （A570）。采用琥珀酸脫氫酶 （SDH）試劑盒，比色法測定線粒體內(nèi)SDH的含有量，進而反映出細胞的代謝狀態(tài)以及存活情況。

2.5 超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛 （MDA）測定 通過試劑盒測定SOD和MDA數(shù)值變化，觀察不同濃度藥物對細胞缺氧狀態(tài)下保護的效果，并對其機制進行初步的探討。

3 實驗結(jié)果

3.1 對照組和藥物保護組海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)變化 損傷對照組：6 h后，海馬神經(jīng)元胞體和突觸的變化更為嚴重，胞膜和突觸膜模糊，有胞膜破裂發(fā)生，部分細胞死亡，胞內(nèi)和突觸內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒；12 h后，大部分海馬神經(jīng)元胞膜破裂，神經(jīng)突觸多已斷裂、崩解，細胞死亡 （圖1）。藥物保護組：加入藥物后觀測，各時間點細胞形態(tài)無明顯變化，海馬神經(jīng)元胞體透光性強且周圍光暈明顯，突觸粗大、生長良好，由突觸相互連成的神經(jīng)突觸網(wǎng)絡(luò)稠密 （圖2）。對比可見，加入藥物后能明顯改善細胞在缺血缺氧環(huán)境中的生活狀態(tài)，藥物對細胞生長有保護和促進作用。

3.2 地黃飲子對缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細胞LDH漏出量的影響 施加處理因素3 h后，損傷對照組與正常對照組相比較，神經(jīng)細胞LDH漏出量水平顯著升高 （P＜0.01）；在藥物保護各組，該指標(biāo)有改善，隨著地黃飲子劑量的變化，各組與損傷組相比，細胞培養(yǎng)上清液中LDH含有量明顯下降，藥物血清與空白血清比例為2∶1時，地黃飲子對神經(jīng)細胞保護作用達到最佳效果（見表1）。

圖1 損傷對照組海馬神經(jīng)元生長狀態(tài) （光鏡下）×100Fig.1 The growth of hippocampus neurons in the control group×100

表1 地黃飲子對缺血缺氧損傷腦海馬神經(jīng)細胞LDH漏出量的影響（±s，n=6）Tab.1 Effects of Dihuang Drink on LDH in hippocampus neurons（±s，n=6）

注：損傷組與對照組比較，aP＜0.01；各藥物保護組與損傷組比較，bP ＜0.01，F(xiàn)=107.182。

組別 LDH/（U·L－1）正常對照組308.81±15.13損傷對照組 968.58±71.82a地黃飲子藥物保護Ⅰ組 560.51±42.34b地黃飲子藥物保護Ⅱ組 456.63±32.39b地黃飲子藥物保護Ⅲ組 354.24±16.01b地黃飲子藥物保護Ⅳ組 577.60±48.17b

3.3 地黃飲子對缺血缺氧神經(jīng)細胞SDH活力和細胞存活率的影響 施加處理因素3 h后各組細胞的SDH活性測定：損傷組與正常對照組相比，培養(yǎng)神經(jīng)細胞內(nèi)SDH酶活性水平顯著降低 （P＜0.01）；在地黃飲子藥物保護各組，指標(biāo)均有改善，與損傷組相比，隨劑量的變化，SDH活性均明顯升高，當(dāng)含藥血清與空白血清比例為2∶1，地黃飲子保護作用最好，并不再隨著濃度的變化而增強。另外，損傷組細胞存活率明顯低于正常對照組。各藥物保護組中，藥物保護1組和4組該指標(biāo)改善不明顯，隨著藥物劑量的改變，與損傷組相比，細胞存活率有提高，當(dāng)含藥血清與空白血清比例為2∶1，保護作用最好 （表2）。

表2 地黃飲子對缺血缺氧神經(jīng)細胞SDH活力及細胞存活率的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of Dihuang Drink on SDH and cell survival rates in anoxyaemia neurons（±s，n=10）

表2 地黃飲子對缺血缺氧神經(jīng)細胞SDH活力及細胞存活率的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of Dihuang Drink on SDH and cell survival rates in anoxyaemia neurons（±s，n=10）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與損傷組比較，bP＜0.05；與損傷組比較，cF=199.145。

組別 OD值 細胞存活率/%正常對照組0.851 1±0.051 5 100.00損傷對照組 0.409 5±0.031 0a 48.12±3.65a藥物保護Ⅰ組 0.449 8±0.014 9ac 52.79±1.76a藥物保護Ⅱ組 0.622 7±0.062 6ac 73.18±7.35b藥物保護Ⅲ組 0.647 2±0.023 7ac 76.05±2.78b藥物保護Ⅳ組 0.429 4±0.021 6ab 50.46±2.54a

3.4 地黃飲子對缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細胞丙二醛（MDA）生成的影響 施加處理因素3 h后海馬神經(jīng)細胞MDA含有量：損傷組明顯高于正常對照組。藥物保護各組，隨藥物劑量變化，與損傷組相比，MDA含有量明顯降低，且藥血清與空白血清比例為2∶1時，保護作用最好強，見表3。

3.5 地黃飲子對缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細胞SOD活力的影響 施加處理因素3 h后海馬神經(jīng)細胞SOD活力：損傷組明顯低于正常對照組。在藥物保護各組，劑量達到一定濃度 （當(dāng)含藥血清與空白血清比例為1∶1～2∶1）范圍，SOD活力明顯高于損傷組，見表3。

表3 地黃飲子對缺血缺氧狀態(tài)下MDA、SOD的影響（±s，n=10）Tab.3 Effects of Dihuang Drink on MDA and SOD in anoxyaemia neurons（±s，n=10）

表3 地黃飲子對缺血缺氧狀態(tài)下MDA、SOD的影響（±s，n=10）Tab.3 Effects of Dihuang Drink on MDA and SOD in anoxyaemia neurons（±s，n=10）

注：與損傷組比較，aP＜0.01，F(xiàn)=90.688。

組別 MDA/（nmol·mL－1） SOD（U·mL－1）正常對照組2.966 0±0.903 6 121.652 6±16.144 3損傷保護組 8.229 8±0.548 2 32.346 7±13.918 5藥物保護Ⅰ組 5.721 4±0.578 5a 78.112 3±10.281 9a藥物保護Ⅱ組 3.910 6±1.039 0a 111.748 1±14.069 7a藥物保護Ⅲ組 3.541 0±0.287 9a 110.509 9±16.348 8a藥物保護Ⅳ組 7.021 7±0.351 6a 48.909 8±9.304

4 討論

腦缺血缺氧導(dǎo)致多種病理生理功能改變。其機制涉及自由基損傷、能量耗竭等方面。各因素導(dǎo)致連鎖反應(yīng)使膜通透性增加，組織水腫、細胞結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞［4］。細胞結(jié)構(gòu)功能的改變更加重能量代謝障礙，與鈣超載及自由基之間相互作用可產(chǎn)生更為廣泛的損傷。

中樞神經(jīng)元含有大量LDH，其化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。通常情況下LDH外漏很少，受損傷時則LDH外漏明顯增多。實驗顯示，缺氧后LDH漏出隨缺氧時間的延長逐漸加重，說明海馬神經(jīng)細胞膜通透性因缺氧而發(fā)生惡化，地黃飲子保護的神經(jīng)細胞比較損傷組：缺氧后形態(tài)變化輕微，細胞存活數(shù)量多，LDH漏出量減少。表明，地黃飲子對神經(jīng)細胞缺氧損傷有保護作用，當(dāng)含藥血清與空白血清比例為2∶1時作用效果最佳并有劑量依賴趨勢。推測該作用可能是地黃飲子通過提高細胞對氧的利用，對缺血缺氧造成的細胞能量代謝降低有拮抗作用，消除了乳酸堆積，保護細胞膜完整性和正常生理功能［5-7］。

地黃飲子由熟地、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、五味子等組成，具有滋腎陰，補腎陽，化痰開竅的功能。有臨床報道表明，地黃飲子治療腦血管性癡呆、腦萎縮、中風(fēng)及后遺癥、運動神經(jīng)元病等，對神經(jīng)系統(tǒng)具有較好的保護作用。應(yīng)用地黃飲子對改善學(xué)習(xí)記憶功的研究表明，地黃飲子可明顯提高細胞呼吸活性，加上地黃飲子對缺氧損傷神經(jīng)細胞SDH的作用結(jié)果，可推測地黃飲子促進細胞線粒體對氧的利用，促進三羧酸循環(huán)，鞏固、提高細胞有氧代謝，為細胞提供足夠能量，以抵抗能量供給不足帶來的影響，最終代謝產(chǎn)物為二氧化碳和水，消除乳酸對細胞的損傷，延長了細胞在缺氧狀態(tài)下的存活時間［8-11］。

腦缺血缺氧等狀態(tài)下自由基大量產(chǎn)生，由于防御機制發(fā)生障礙或數(shù)量關(guān)系，不能將自由基及時徹底清除，自由基得以產(chǎn)生損害作用［12-14］，SOD是最主要的自由基清除酶，也是機體阻斷自由基病理性連鎖反應(yīng)的防御酶。脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物為MDA。實驗顯示，地黃飲子能顯著降低缺血后神經(jīng)細胞MDA含有量，并有劑量依賴性，說明地黃飲子能降低缺血腦細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，間接提示地黃飲子可以降低腦組織氧自由基的水平。與正常組比較損傷組SOD活性顯著下降，各地黃飲子組，在一定程度逆轉(zhuǎn)缺血缺氧損傷后SOD活性的下降，維持組織對氧自由基的清除能力，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，保護細胞膜，使LDH漏出量減少，抑制乳酸增加。提高SOD活性，降低氧自由基含有量可能是地黃飲子對腦缺血損傷產(chǎn)生保護作用的機制。

地黃飲子對于保護SOD活力、減少脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的生成、提高神經(jīng)細胞線粒體呼吸能力等作用預(yù)示了這種藥物有著重要的應(yīng)用價值，在神經(jīng)系統(tǒng)缺血-缺氧性疾病的治療中有廣闊的應(yīng)用前景。

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Protective effect and mechanism of Dihuang Drink on the hypoxic injury to hippocampal neurons

LI Zi-jun， LIU Chun-na*
（Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

AIMTo observe the protective effect and mechanism of Dihuang Drink（Rehmanniae Radix praeparata，Morindae officinalis Radix，Corni Fructus，Dendrobii Caulis，Cistanches Herba，etc.）on the anoxaemia of cultured hippocampal neurons.METHODSCultured hippocampal neurons were divided into three groups：control group，model group and drug-protective group.Hypoxia induced by 1 mol/L Na2S2O4in low sugar solution on hippocampal neurons for 3 h in the model group，while different concentrations of Dihuang Drink were added at the same time in the drug-protective group.Colorimetric method was used to test the concentration of delectate hydrogenase（LDH），and MTT method was applied to observing the hippocampus cell survival.The content of succinic dehydrogenase（SDH）in mitochondria was intended to reflect the protection and effective concentration of Dihuang Drink.Moreover，the changes of malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）were measured in the cultured hippocampal neurons.RESULTSDihuang Drink had protective effect on hippocampal neurons at ratio of the concentration of Dihuang Drink to blank serum（1∶3 to 3∶1）.Decrease in the release of LDH could reduce the damage to cell membrane.The increase in MTT value meaned cell activity was enhanced and cell energy metabolism was improved.Moreover，Dihuang Drink concentration-dependently increased the content of SOD and decreased the MDA（P ＜0.01）in the hypoxic hippocampal neurons.CONCLUSIONDihuang Drink has an obvious protective effect on the hypoxic hippocampal neuron via decreasing free radicals injury.

Dihuang Drink；hippocampal neurons；anoxyaemia；oxygen free radicals

R285.5

A

1001-1528（2012）08-1421-04

2012-03-01

遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目 （LT2010065）；遼寧省自然科學(xué)基金項目 （20102139）

李子軍 （1963—）男，高級實驗師，主要從事中藥藥理工作。

*通信作者：劉春娜 （1977—），女，副教授，博士，主要從事中藥藥理工作。Tel：（0416）4673465，Email：springnana@tom.com