樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗預(yù)防接種聯(lián)合吉西他濱治療可提高胰腺癌小鼠模型的生存率

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物治療科 汪治宇 王聰敏 王 娟

引言

胰腺癌是西方世界第五大致死性癌癥，其5年總生存率小于5%[1]。胰十二指腸切除術(shù)是治愈胰腺癌唯一的手段，但確診患者中只有10%～15% 適合手術(shù)治療。應(yīng)用吉西他濱化療是目前治療晚期胰腺癌最有效的方法，其生存率相較于應(yīng)用5-氟尿嘧啶(5-FU)治療有中度升高[2,3]。近來(lái)實(shí)驗(yàn)中尚無(wú)證據(jù)表明吉西他濱聯(lián)合其他化療藥物可提高生存率[4]，因此我們需要找尋治療晚期胰腺癌的新策略。胰腺癌細(xì)胞可以被腫瘤特異性T細(xì)胞識(shí)別[3-6]，而且腫瘤被細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)及輔助性T細(xì)胞浸潤(rùn)是胰腺癌病人良好的預(yù)后因素[7]?？梢种颇[瘤的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞也可以從胰腺癌患者血液中分離出來(lái)[8]。

樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)瘤苗接種可激活腫瘤特異性T細(xì)胞[9,10]。DCs是具有獨(dú)特的建立初級(jí)免疫反應(yīng)能力的專門的抗原提呈細(xì)胞[11]。DCs可將外源性抗原呈遞給主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)，進(jìn)而形成激活CTLs的通路，這個(gè)過(guò)程稱為“交叉遞呈”[12]。接觸微生物的或炎性“危險(xiǎn)信號(hào)”也可以像接觸T細(xì)胞源性激活信號(hào)那樣誘導(dǎo)DC成熟及白介素(IL)12分泌[13,14]。IL-12在調(diào)節(jié)腫瘤定向免疫反應(yīng)及通過(guò)激發(fā)自然殺傷(NK)細(xì)胞、CTLs及干擾素(IFN)γ來(lái)產(chǎn)生1型輔助性T細(xì)胞(Th1)的過(guò)程中起中心作用。接種負(fù)載腫瘤抗原的DCs瘤苗已被證實(shí)可以誘導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤的CTL反應(yīng)，并且可誘發(fā)癌癥病人的腫瘤縮小[9,15-17]。接種負(fù)載腫瘤抗原的DCs瘤苗后，胰腺癌細(xì)胞在體內(nèi)會(huì)被排斥[18,19]，然而腫瘤能夠在其周圍構(gòu)建一個(gè)對(duì)CTLs不敏感的免疫抑制環(huán)境。與其他治療策略如放化療聯(lián)合可打破癌細(xì)胞的免疫抵抗并可增強(qiáng)DC瘤苗接種的療效。

吉西他濱不僅發(fā)揮直接的抗腫瘤活性，還可以介導(dǎo)與腫瘤免疫治療相關(guān)的免疫學(xué)效應(yīng)[20-22]。經(jīng)吉西他濱在內(nèi)的多種藥物治療后，CTL反應(yīng)也可通過(guò)DCs交叉遞呈腫瘤細(xì)胞抗原而誘發(fā)[23]。吉西他濱治療可促進(jìn)DCs對(duì)腫瘤抗原的交叉遞呈，這也提高了體內(nèi)CTLs對(duì)腫瘤的識(shí)別能力[24]。近來(lái)，我們證實(shí)了吉西他濱可增加人類胰腺癌細(xì)胞對(duì)DC誘導(dǎo)的腫瘤特異性CTL反應(yīng)的敏感性[25]。本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用胰腺癌小鼠模型來(lái)研究吉西他濱是否可以提高樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗體內(nèi)接種的療效。

1 材料與方法

1.1 小鼠，細(xì)胞株和培養(yǎng)液

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由德國(guó)慕尼黑Regierung von Oberbayern批準(zhǔn)。C57BL/6小鼠來(lái)自Harlan Winkelmann(博爾興，德國(guó))。C57BL/6背景的轉(zhuǎn)基因OT-1動(dòng)物由Brocker 教授提供(慕尼黑大學(xué)免疫學(xué)系)。OT-1 T細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清(FCS;Gibco,Invitrogen公司，Paisley，英國(guó))、青霉素及鏈霉素的RPMI培養(yǎng)液(Biochrome，柏林，德國(guó))中。H2-b陽(yáng)性細(xì)胞株P(guān)ancO2來(lái)源于C57BL/6 小鼠體內(nèi)被甲基苯蒽誘發(fā)的胰腺癌[26,27]。PancO2細(xì)胞保存在含10%FCS、2mML-谷氨酰胺(生命技術(shù)公司，Paisley，英國(guó))、100U/ml青霉素(Sigma，慕尼黑，德國(guó))及100μg/ml鏈霉素(Seromed,Julich,德國(guó))的RPMI培養(yǎng)液中。在與DCs共同培養(yǎng)之前，PancO2已被紫外線B以0.75J/cm2的強(qiáng)度照射過(guò)。經(jīng)紫外線照射后仍存活的腫瘤細(xì)胞通過(guò)光學(xué)顯微鏡及胸苷摻入法被排除。H2-Kb陽(yáng)性淋巴細(xì)胞株EL4(由Enders教授，Institut fur Chirurgische Forschung，慕尼黑大學(xué)，惠贈(zèng))保存在含10%FCS、青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。

1.2 mRNA提取及反轉(zhuǎn)錄PCR

標(biāo)本先在磷酸緩沖液(PBS)中清洗，然后在液氮中冰凍切片并儲(chǔ)存在-70℃的環(huán)境中。采用均質(zhì)勻漿儀(Janke und Kunkel，施陶芬，德國(guó))對(duì)組織進(jìn)行均勻退火，然后應(yīng)用羅氏總RNA組織提取試劑盒(羅氏，曼海姆，德國(guó))分離總RNA。RNA儲(chǔ)存于等容量的酒精中并置于－80℃的環(huán)境中。通過(guò)光譜分析檢測(cè)RNA的收率及純度。反轉(zhuǎn)錄運(yùn)用了M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco 生命技術(shù)公司，Paisley，英國(guó))、RNA酶抑制劑(羅氏，曼海姆，德國(guó))以及dNTP(Promega，麥迪遜，德國(guó))。PCR應(yīng)用了Taq DNA聚合酶并按照供應(yīng)商(羅氏，曼海姆，德國(guó))推薦的方式進(jìn)行。引物采用Applied Biosystems(Weiterstadt，德國(guó))根據(jù)文獻(xiàn)提供的序列研制而成[28]。

1.3 單克隆抗體及流式細(xì)胞術(shù)

為進(jìn)行表型分析，DCs與5μg/2×105細(xì)胞抗小鼠CD86-FITC單克隆抗體(mAb；克隆GL1)、CD11b-PerCP mAb(克隆 M1/70)、CD11c-APC mAb(克隆HL3；全部來(lái)自BD Biosciences公司，SanJose，認(rèn)證中心，美國(guó))、MHCⅡ-PE mAb(克隆 NIMR-4，南方生物技術(shù)公司，伯明翰，AL，美國(guó))以及合適的同型對(duì)照一起在4℃的環(huán)境中培養(yǎng)30min。細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur，BD Biosciences，海德?tīng)柋?，德?guó))檢驗(yàn)。應(yīng)用CellQuest軟件(BD Biosciences，海德?tīng)柋?，德?guó))分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用抗小鼠mAb(H2-Kb，克隆AF6-88.5；和H2-Db，克隆KH95，二者均來(lái)自BD Biosciences，San Jose，CA，美國(guó))檢測(cè)MHCⅠ的表達(dá)。

1.4 肽

H2-Kb限制性抗原肽OVA257-264、TRP2181-188以及p15E604-611均來(lái)自Peptide Technologies(柏林，德國(guó))[29-31]。

1.5 試劑

吉西他濱來(lái)自Lilly(Indianapolis，IN，美國(guó))。咪達(dá)唑侖(Roche，巴塞爾，瑞士)，medetomidin(Orion公司，Espoo，芬蘭)，芬太尼(Janssen-Cilag，諾伊斯，德國(guó))以及納洛酮(Deltaselect，Dreieich，德國(guó))被用來(lái)麻醉。

1.6 細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、刺激劑和ELISAs

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFNγ、IL-1β、IL-2以及IL-4來(lái)自PeproTech(倫敦，英國(guó))，IFNα來(lái)自HyCult Biotechnology(Uden，荷蘭)。內(nèi)毒素(LPS)，p:IC，R848和腫瘤壞死因子α(TNFα)均來(lái)自Sigma-Aldrich(Steinheim，德國(guó))。IL-12p70、IL-12p40和IFNγ的小鼠ELISA試劑盒均來(lái)自BD Biosciences(San Diego，CA，美國(guó))。

1.7 骨髓源性DCs的生成及其抗原負(fù)載

如述制備骨髓源性DCs[32]。骨髓細(xì)胞采集自小鼠的股骨和脛骨。將紅細(xì)胞溶解于氯化銨緩沖液(BD Biosciences，海德?tīng)柋?，德?guó))。細(xì)胞以5×105個(gè)/cm2的密度培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中，并向培養(yǎng)液中加入10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml鏈霉素、1IU/ml青霉素、20ng/ml GM-CSF以及20ng/ml IL-4(DC培養(yǎng)液)。7天后可獲得粘連松散的細(xì)胞，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選器(FACS)對(duì)DC標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行量化。DCs占制備細(xì)胞的70%。以DC/腫瘤細(xì)胞比值為10:1的比例將DCs與PancO2(后文被稱作“激發(fā)”)細(xì)胞共同培養(yǎng)，最后24h加入LPS(250ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)。九天后可-獲得粘連松散的細(xì)胞，沖洗后置于RPMI中再懸浮并通過(guò)FACS進(jìn)行分析。

1.8 腫瘤誘發(fā)及瘤苗接種策略

作為預(yù)防性接種，最終容積為200μl含3×105DCs的RPMI從小鼠右脅腹經(jīng)皮下注射，對(duì)側(cè)脅腹皮下注射PancO2(1×106于200μlRPMI)，以使小鼠受到腫瘤威脅。治療性接種在腫瘤形成可觸性結(jié)節(jié)后開(kāi)始進(jìn)行。吉西他濱以25或50mg每公斤體重腹腔內(nèi)給藥，每周2次。腫瘤生長(zhǎng)以直徑的乘積表示。當(dāng)腫瘤的大小超過(guò)400mm2或觀察到動(dòng)物的窘迫征象在48h內(nèi)加倍時(shí)動(dòng)物將被處死。為了原位腫瘤更好發(fā)展，在麻醉狀態(tài)下切開(kāi)小鼠的左脅腹，移除脾臟以接納胰腺。總量達(dá)2×105PancO2細(xì)胞被注射入胰腺。通過(guò)LaThetaTM型小型動(dòng)物體內(nèi)CT掃描儀(Zinsser Analytic)來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。動(dòng)物CT掃描是在Heinz-Peter Scheuber教授(TierschutzInformationsZentrum for生物醫(yī)學(xué)研究所，慕尼黑大學(xué))與Adam Glowalla(Zinsser Analytic，德國(guó))的協(xié)助下進(jìn)行的。

1.9 體內(nèi)細(xì)胞毒性檢測(cè)

檢測(cè)通過(guò)將羧基熒光素雙乙酸-琥珀酰亞胺酯(CFSEhigh，2μM；CFSElow， 0.2μM)標(biāo)記的C57BL/6淋巴細(xì)胞導(dǎo)入接種了或未進(jìn)行接種的小鼠來(lái)進(jìn)行。CFSEhigh標(biāo)記的細(xì)胞由p15E肽(2μg/ml)來(lái)刺激，而CFSElow標(biāo)記的細(xì)胞則未被刺激。靶細(xì)胞注入20h后，將CFSEhigh及CFSElow標(biāo)記的細(xì)胞以1:1的比例經(jīng)腹腔注入，移除脾臟，CFSEhigh與CFSElow細(xì)胞的比值由流式細(xì)胞術(shù)決定。細(xì)胞毒性通過(guò)以下公式計(jì)算：接種小鼠：CFSEhigh/CFSElow；未接種小鼠：CFSEhigh/CFSElow。

圖1 骨髓源性DCs能夠攝取腫瘤抗原，并且可以在LPS及IFNγ的刺激下分泌IL-12p70。DCs來(lái)源于與粒-巨細(xì)胞集落刺激因子和IL-4共同培養(yǎng)的C57BL/6小鼠骨髓。在培養(yǎng)的第6天，將DCs與經(jīng)紫外線照射的CFSE標(biāo)記的PancO2細(xì)胞以10:1的比例共同孵育。CD11c+DCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的攝取通過(guò)FACS分析測(cè)定(A所示為5組FACS分析中有代表性的一組結(jié)果)。在培養(yǎng)的第6天，用不同的刺激來(lái)激發(fā)DCs，持續(xù)24h。用ELISA分析所獲上清液中IL-12的產(chǎn)量。[B所示數(shù)據(jù)為兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(SEM)]

1.10 體外細(xì)胞毒性測(cè)定

我們?cè)谀侥岷诖髮W(xué)免疫學(xué)系的R Wank教授的協(xié)助下進(jìn)行了51鉻釋放檢測(cè)。首先在37℃的環(huán)境中，將靶細(xì)胞在Na251CrO4(100μCi/106靶細(xì)胞)溶液中孵育1h，然后將細(xì)胞沖洗3遍，再與效應(yīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)于96孔圓底培養(yǎng)板上(5×103/孔)，總體積為200μl。在37℃的環(huán)境中孵育4h后，獲得50μl上清液，應(yīng)用伽馬計(jì)數(shù)器(Wallac Oy，土爾庫(kù)，芬蘭)檢測(cè)其放射性。通過(guò)以2.5%的最終濃度與曲通X-100絡(luò)合體系(Sigma，慕尼黑，德國(guó))共同培養(yǎng)來(lái)評(píng)估最大釋放量。在不存在效應(yīng)細(xì)胞的情況下測(cè)定自發(fā)性釋放量。根據(jù)以下公式計(jì)算特異性殺傷性：特異性51Cr釋放=[(實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)-自發(fā)性計(jì)數(shù))/(最大計(jì)數(shù)-自發(fā)計(jì)數(shù))]×100%。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用司徒登氏t測(cè)驗(yàn)來(lái)顯示在腫瘤防護(hù)上的顯著差異。我們比較了對(duì)照組動(dòng)物及所有經(jīng)過(guò)處理的動(dòng)物(包括無(wú)腫瘤及腫瘤陽(yáng)性的動(dòng)物)的腫瘤大小。–應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析Kaplan-Meier生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 接種經(jīng)PancO2激發(fā)的DCs可抑制皮下腫瘤的發(fā)展

圖2 預(yù)防性接種PancO2激發(fā)的DCs瘤苗可全面阻止皮下PancO2腫瘤的發(fā)展。年齡為6～10周的雌性C57BL/6小鼠分別作如下處理：皮下接種PancO2激發(fā)的同系DCs(3×105)，或未被激發(fā)的同系DCs(3×105)，或經(jīng)紫外線照射的PancO2細(xì)胞(1×105)，以上均為每隔一周注射3次，或不作處理。最后一次接種后的第7天，所有小鼠均接受1×106PancO2細(xì)胞皮下注射。定期檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，腫瘤大小以直徑之積來(lái)檢測(cè)(A所示數(shù)據(jù)未每組中3只動(dòng)物的平均值(SEM))。在平行實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠均在兩次接種后被處死，淋巴細(xì)胞的體外INFγ產(chǎn)量通過(guò)ELISA來(lái)檢測(cè)[B所示數(shù)據(jù)未每組中兩只動(dòng)物的平均值(SEM)]。AG：抗原。

我們前期曾提出經(jīng)紫外線照射而凋亡的腫瘤細(xì)胞激發(fā)的DCs在啟動(dòng)抗人胰腺癌細(xì)胞CTLs方面優(yōu)于腫瘤溶解產(chǎn)物激發(fā)的DC[33]，此發(fā)現(xiàn)近期已在PancO2腫瘤模型中被證實(shí)[34]。因此，我們選擇經(jīng)紫外線照射的PancO2細(xì)胞作為腫瘤抗原的來(lái)源。骨髓源性DCs能夠攝取死亡的PancO2細(xì)胞，并且可以在LPS及IFNγ的刺激下分泌IL-12p70(圖1)。經(jīng)三次PancO2激發(fā)的DCs瘤苗接種可完全阻止小鼠腫瘤的發(fā)展(圖2A)。未經(jīng)處理的小鼠的腫瘤可在35天之內(nèi)發(fā)展至平均大小為110mm2(圖2B)。只有僅接受經(jīng)紫外線照射的PancO2細(xì)胞或接受未負(fù)載的DCs的小鼠的腫瘤會(huì)中度縮小(即35天后腫瘤平均大小約為44mm2)。接種了PancO2激發(fā)的DCs瘤苗的小鼠的腫瘤防護(hù)與經(jīng)兩次接種后孤立淋巴細(xì)胞高水平分泌IFNγ有關(guān)(圖2B)。

圖3 預(yù)防性接種PancO2激發(fā)的DCs誘導(dǎo)與長(zhǎng)期腫瘤防護(hù)相關(guān)的免疫記憶。年齡為6～10周的雌性C57BL/6小鼠分別作如下處理：皮下接種PancO2激發(fā)的同系DCs(3×105)，或未被激發(fā)的同系DCs(3×105)，或經(jīng)紫外線照射的PancO2細(xì)胞(1×105)，以上均為每隔一周注射3次，或不作處理。最后一次接種后的第7天，所有小鼠均接受1×106PancO2細(xì)胞皮下注射。定期檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，腫瘤大小以直徑之積來(lái)檢測(cè)。接受DC瘤苗接種的小鼠仍保持無(wú)瘤狀態(tài)，并在初始腫瘤接種后的第95天再次皮下注射1×106PancO2腫瘤細(xì)胞。事先未經(jīng)處理的小鼠充當(dāng)對(duì)照組[圖所示數(shù)據(jù)未每組中3只動(dòng)物的平均值(SEM)]。AG：抗原。

2.2 接種經(jīng)PancO2激發(fā)的DCs可建立免疫記憶及長(zhǎng)期腫瘤防護(hù)

受到PancO2細(xì)胞威脅的對(duì)照組動(dòng)物在40～50天后死亡，而預(yù)防性接種了PancO2激發(fā)的DCs瘤苗的小鼠可無(wú)瘤生存3個(gè)月以上。這些小鼠在第一次腫瘤威脅95天后再次受到PancO2細(xì)胞的攻擊。如圖3所示，相較于對(duì)照組迅速長(zhǎng)大的腫瘤(第26天腫瘤平均大小為91mm2)，接種瘤苗的小鼠仍然可以抵抗腫瘤發(fā)展。接種瘤苗的小鼠在第95天再次受到PancO2攻擊，但仍可長(zhǎng)期存活且數(shù)月后仍沒(méi)有局部或系統(tǒng)性腫瘤生長(zhǎng)，最終對(duì)其施以安樂(lè)死。

2.3 接種經(jīng)PancO2激發(fā)的DCs可誘導(dǎo)腫瘤特異性CTLs

盡管小鼠腫瘤的發(fā)展可以對(duì)抗，DC瘤苗接種誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL反應(yīng)仍有待于證實(shí)。病毒相關(guān)性的小鼠白血病病毒(MuLV)env-蛋白由gp70基因編碼并由小鼠癌細(xì)胞選擇性表達(dá)。圖4A表明gp70 mRNA表達(dá)于來(lái)源于Balb/C小鼠的PancO2及C26結(jié)腸癌細(xì)胞，但不表達(dá)于正常組織。將負(fù)載MuLV env-蛋白源性p15E肽的來(lái)源于Balb/C小鼠的CFSEhigh標(biāo)記的淋巴細(xì)胞及CFSElow標(biāo)記的、未負(fù)載的淋巴細(xì)胞注入接種了三次PancO2激發(fā)的DCs瘤苗或未作處理的小鼠的尾靜脈。相較于未處理的動(dòng)物，通過(guò)使接種過(guò)的動(dòng)物的p12E負(fù)載的CFSEhigh淋巴細(xì)胞達(dá)標(biāo)，可算得約12%的特異性殺傷率(圖4B)。因此，PancO2負(fù)載的DCs不僅可對(duì)抗腫瘤發(fā)展，還能夠誘導(dǎo)免疫記憶及腫瘤特異性CTL反應(yīng)。

圖4 接種PancO2激發(fā)的DCs可誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)。H2-kb-限制性肽p15E來(lái)源于病毒相關(guān)的gp70基因所編碼的小鼠白血病env蛋白。gp70 mRNA的表達(dá)可在PancO2細(xì)胞、C26克隆癌細(xì)胞(來(lái)源于Balb/c小鼠品系)以及C57BL/6小鼠的肝臟、脾臟、胰腺及淋巴結(jié)的標(biāo)本中檢測(cè)到(A)。為了檢測(cè)體內(nèi)p15E特異性CTLs，將負(fù)載p15E肽的來(lái)源于Balb/C小鼠的CFSEhigh標(biāo)記的淋巴細(xì)胞及CFSElow標(biāo)記的、未負(fù)載的淋巴細(xì)胞注入接種了三次PancO2激發(fā)的DCs瘤苗或未作處理的小鼠的尾靜脈。20小時(shí)后，移除脾臟，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同標(biāo)記的淋巴細(xì)胞的頻度。通過(guò)使接種過(guò)的動(dòng)物的p12E負(fù)載的CFSEhigh淋巴細(xì)胞相較于未經(jīng)處理動(dòng)物的相對(duì)減少量達(dá)標(biāo)來(lái)檢測(cè)特異性殺傷(B所示數(shù)據(jù)未4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(SEM))。

2.4 腫瘤特異性CTLs可識(shí)別并殺傷PancO2細(xì)胞

與人類胰腺癌相似，PancO2源性腫瘤是弱免疫原性的。而且，PancO2細(xì)胞僅低水平表達(dá)經(jīng)典CTL介導(dǎo)的殺傷所需的MHCⅠ(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們?cè)趯ancO2細(xì)胞應(yīng)用于體內(nèi)治療性接種模型前先分析了其在體外能否被抗原特異性CTLs識(shí)別。我們應(yīng)用了特異性針對(duì)OVA表位SIINFEKL的來(lái)源于轉(zhuǎn)基因OT-1動(dòng)物的CTLs[35,36]。在51Cr釋放檢驗(yàn)中，負(fù)載SIINFEKL肽或者不相關(guān)對(duì)照肽的PancO2細(xì)胞與來(lái)源于野生型小鼠或OT-1小鼠的淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)。負(fù)載SIINFEKL肽或者不相關(guān)肽的EL4細(xì)胞被用作對(duì)照目標(biāo)。負(fù)載SIINFEKL的PancO2細(xì)胞可被轉(zhuǎn)基因OT-1小鼠源性淋巴細(xì)胞特異性殺傷(見(jiàn)圖5)。

2.5 DC瘤苗接種聯(lián)合吉西他濱可提高PancO2胰腺癌模型的生存率

圖5 PancO2細(xì)胞可被抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞以MHCⅠ限制性的方式識(shí)別并殺傷。在51Cr釋放檢驗(yàn)中，負(fù)載SIINFEKL肽或者不相關(guān)對(duì)照肽的PancO2細(xì)胞與來(lái)源于野生型C57B/6小鼠或OT-1小鼠的淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，效應(yīng)子與目標(biāo)子的比值從3.125:1到100:1，負(fù)載SIINFEKL肽或者不相關(guān)肽的EL4細(xì)胞與來(lái)源于轉(zhuǎn)基因OT-1小鼠的淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，被用作陽(yáng)性對(duì)照。

注入PancO2細(xì)胞后的第14天，我們建立了4個(gè)腫瘤大小相當(dāng)(約13mm2)的實(shí)驗(yàn)組。對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行如下處理：不作處理(對(duì)照)，PancO2激發(fā)的DCs(DC)，吉西他濱(Gem)和PancO2激發(fā)的DCs加吉西他濱(DC+Gem)。吉西他濱每周給2次藥，50mg/kg，在聯(lián)合治療方案中，則分別在接種DCs前后兩天給藥。治療共持續(xù)5周。如圖6A所示，治療開(kāi)始后第58天，對(duì)照組動(dòng)物已全部死亡，單獨(dú)DC瘤苗接種與吉西他濱治療在預(yù)防死亡方面效果相當(dāng)(治療第58天生存率分別為14%和17%；DC接種對(duì)對(duì)照組和吉西他濱對(duì)對(duì)照組P分別為0.13和0.08)。與每種治療策略單獨(dú)應(yīng)用相比，聯(lián)合治療方案可使生存率顯著提高(治療第58天生存率為50%；聯(lián)合治療對(duì)對(duì)照組P＜0.005)。在所有治療組中局部腫瘤生長(zhǎng)均受到抑制，在治療開(kāi)始后第32天時(shí)，對(duì)照組、DC接種組、吉西他濱組及聯(lián)合治療組的腫瘤平均大小分別為：123mm2、91mm2、85mm2和67mm2。但是，在于對(duì)照組比較時(shí)，這些結(jié)果均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖6B)。DC瘤苗接種加吉西他濱治療使動(dòng)物生存率升高不僅僅是相加效應(yīng)，而且吉西他濱單獨(dú)治療不足以顯著提高生存率或抑制局部腫瘤生長(zhǎng)，因此，我們推測(cè)吉西他濱治療與DC瘤苗接種之間存在著獨(dú)立于藥物直接的細(xì)胞毒性效應(yīng)之外的協(xié)同作用。為了驗(yàn)證此假設(shè)，我們將吉西他濱劑量減半并重復(fù)了該實(shí)驗(yàn)。如圖7所示，劑量為50mg/kg和25mg/kg的吉西他濱聯(lián)合DC瘤苗接種均可提高帶PancO2腫瘤小鼠的生存率(DC+吉西他濱50mg/kg對(duì)對(duì)照組P=0.01；DC+吉西他濱25mg/kg對(duì)對(duì)照組P=0.001)。如前，兩種治療策略單獨(dú)應(yīng)用均不足以顯著提高生存率(DC瘤苗接種單獨(dú)治療對(duì)對(duì)照組P=0.98；吉西他濱單獨(dú)治療對(duì)對(duì)照組P=0.18)。

圖6 DC瘤苗接種聯(lián)合吉西他濱治療可提高皮下PancO2小鼠胰腺癌模型的生存率。將0.5×106PancO2細(xì)胞經(jīng)皮下注射入年齡為6到10周的雌性C57BL/6小鼠體內(nèi)。在腫瘤接種后的第14天，我們建立了4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行如下處理：不作處理(n=5；對(duì)照)，隔周接種PancO2激發(fā)的DCs瘤苗(n=7；DC)，每周兩次腹腔內(nèi)注射吉西他濱(50mg/kg體重)(n=6；Gem)以及PancO2激發(fā)的DCs聯(lián)合吉西他濱(n=6；DC+Gem)。治療共持續(xù)5周。以Kaplan-Meier圖表來(lái)描述各組的生存率(A)。定期檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)，腫瘤大小以直徑之積來(lái)檢測(cè)(B)。圖所示數(shù)據(jù)為各組動(dòng)物相關(guān)數(shù)據(jù)的平均值(SEM)。

2.6 接種PancO2激發(fā)的DCs瘤苗可預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移及原位生長(zhǎng)

對(duì)未經(jīng)處理或已接種3次PancO2激發(fā)的DCs瘤苗的小鼠，于末次接種后的第7天，經(jīng)尾靜脈注入25×104PancO2細(xì)胞。如圖8A所示，未經(jīng)處理的小鼠60天內(nèi)全部死亡，相反，此模型中PancO2激發(fā)的DCs瘤苗防止了死亡發(fā)生。組織病理學(xué)分析證實(shí)了未經(jīng)處理的小鼠肺內(nèi)存在腫瘤細(xì)胞(圖8B)。我們?cè)谝粋€(gè)原位腫瘤模型中檢測(cè)了DC瘤苗接種抑制局部腫瘤生長(zhǎng)的能力。一組小鼠不作處理，另一組小鼠經(jīng)皮下接種3×105負(fù)載PancO2的DCs。最后一次接種后的第7天，如材料及方法部分所述，將2×105PancO2細(xì)胞注射入胰腺。誘瘤后的第19天，切除肉眼可見(jiàn)的腫瘤并對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。對(duì)照組中，腫瘤體積約達(dá)400mm2，平均重量為400mg(圖9，左)；而預(yù)防性接種PancO2負(fù)載的DCs完全阻止了原位PancO2腫瘤的生長(zhǎng)(DC接種對(duì)對(duì)照組P=0.014)。一臺(tái)試驗(yàn)用小型動(dòng)物CT掃描儀被用來(lái)監(jiān)測(cè)一些動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。胰腺內(nèi)注射PancO2細(xì)胞3周后，未經(jīng)處理的動(dòng)物的腫瘤直徑約達(dá)1cm(圖9；右側(cè)，上方)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中我們首次證實(shí)了DC瘤苗接種可聯(lián)合吉西他濱來(lái)提高胰腺癌小鼠模型的生存率，此外，我們還證實(shí)了預(yù)防性接種DC瘤苗可預(yù)防小鼠PancO2胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和原位生長(zhǎng)。我們選擇PancO2小鼠腫瘤模型因?yàn)槠淙趺庖咴允穷愃朴谌祟愐认侔┑牡湫吞卣髦籟37]。然而，盡管MHCⅠ低水平表達(dá)，PancO2細(xì)胞仍可被CTLs識(shí)別并殺傷，而且免疫治療方法在此模型中行之有效[27,28]。首先，我們證實(shí)了PancO2誘發(fā)的DCs可建立與長(zhǎng)期腫瘤防護(hù)有關(guān)的免疫記憶并能夠誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL反應(yīng)。值得注意的是，具有體內(nèi)細(xì)胞溶解能力的肽特異性CTLs負(fù)載于多克隆全細(xì)胞抗原制劑的DCs誘導(dǎo)。腫瘤的CTLs浸潤(rùn)有利于胰腺癌及其他實(shí)體癌的預(yù)后[7,39]。我們尚無(wú)法通過(guò)組織病理學(xué)檢測(cè)DC瘤苗接種后T細(xì)胞浸潤(rùn)的增加，同時(shí)在治療性皮下模型上腫瘤大小縮小并不顯著。然而，我們的數(shù)據(jù)顯示DC瘤苗接種可以預(yù)防腫瘤經(jīng)血液播散所致的死亡以及抑制肺轉(zhuǎn)移的形成。這與在B16小鼠黑色素瘤模型上的發(fā)現(xiàn)相一致：盡管瘤苗接種治療無(wú)法阻止B16小鼠黑色素瘤的局部生長(zhǎng)，但其在抗肺轉(zhuǎn)移性疾病方面仍然有效[30,40]。

圖9 預(yù)防性接種負(fù)載PancO2的DCs瘤苗可阻止原位腫瘤的生長(zhǎng)。一組小鼠不作處理，另一組小鼠經(jīng)皮下接種3×105負(fù)載PancO2的DCs。最后一次接種后的第7天，開(kāi)腹切除脾臟并將2×105PancO2細(xì)胞注射入胰腺。手術(shù)后的第19天，切除腫瘤并稱重(左，數(shù)據(jù)為各組的平均值(SEM))。用CT掃描來(lái)監(jiān)測(cè)一些動(dòng)物體內(nèi)原位腫瘤的生長(zhǎng)。胰腺內(nèi)注射PancO2細(xì)胞19天后未經(jīng)處理的對(duì)照動(dòng)物(右，上)及接種瘤苗動(dòng)物(右，下)的典型腹部CT掃描如圖所示。

盡管全部負(fù)載異位PancO2腫瘤的小鼠最終均死于該病，但其中一些仍在負(fù)載著相當(dāng)大的皮下腫瘤的情況下生存了很長(zhǎng)時(shí)間。相反的，負(fù)載原位腫瘤的小鼠則在腹腔轉(zhuǎn)移形成后迅速死于消耗綜合征。重要的是，預(yù)防性皮下DC瘤苗接種完全阻止了原位腫瘤的生長(zhǎng)。所以，DC瘤苗接種誘導(dǎo)的系統(tǒng)免疫反應(yīng)能夠抑制腹腔內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。盡管Takigawa等人之前在胰腺癌倉(cāng)鼠模型上已證實(shí)腹腔內(nèi)注射腫瘤溶解產(chǎn)物激發(fā)的DCs可以抑制原位腫瘤的腹腔內(nèi)播散[41]，這仍是一個(gè)重要的新發(fā)現(xiàn)。盡管尚未被正式地驗(yàn)證，但似乎DC瘤苗接種所誘導(dǎo)的循環(huán)的腫瘤特異性CTLs能夠進(jìn)入腹腔，從而識(shí)別并殺死腫瘤細(xì)胞。因此，輔助性DC瘤苗接種對(duì)于預(yù)防胰腺癌病人胰腺十二指腸切除術(shù)后浸潤(rùn)的或局部殘留的腫瘤細(xì)胞所致的腫瘤復(fù)發(fā)可能有效。盡管DC瘤苗接種與吉西他濱在治療組效果相當(dāng)，但二者均既不能阻止已建立的腫瘤的進(jìn)展，也不能顯著降低死亡率。眾所周知，PancO2細(xì)胞對(duì)化療相對(duì)耐藥，而瘤苗接種無(wú)效則可能由于腫瘤所致的免疫抑制環(huán)境(如，對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫不利的可溶性因子如IL-10或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β的分泌)，效應(yīng)細(xì)胞接觸腫瘤組織受限或者腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞失活，這也是其另一個(gè)與人類胰腺癌相似的特征[7,42]。如果聯(lián)合DC瘤苗接種和吉西他濱，帶瘤小鼠的生存率會(huì)顯著提高。這與之前發(fā)現(xiàn)的吉西他濱可提高體內(nèi)CD40配基化所激發(fā)的免疫的效果[24]相一致。在我們的模型上吉西他濱提高DC瘤苗接種效果的確切機(jī)制尚不清楚。在一個(gè)人類體外模型中，我們證實(shí)了藥物可以增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)CTL反應(yīng)的敏感性[25]。其他人已證實(shí)吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡可增加腫瘤內(nèi)DCs向CTLs交叉遞呈腫瘤抗原[24]?；熕碌拿庖咭种瓶赡軙?huì)限制其與腫瘤的免疫治療方法的聯(lián)合。盡管有報(bào)道稱在動(dòng)物模型中吉西他濱可抑制B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[43]，但它仍可用于胰腺癌患者而不會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞和DC功能的相關(guān)缺失[22]。此外，初步數(shù)據(jù)顯示吉西他濱甚至可以抑制Th2及特異性擴(kuò)大癌癥患者體內(nèi)的Th1型免疫反應(yīng)[22]。吉西他濱在局部腫瘤環(huán)境上的治療效果以及腫瘤抗原特異性的CTLs的頻率和作用目前仍在研究中。

盡管臨床試驗(yàn)已證實(shí)DC瘤苗接種可規(guī)律性的建立腫瘤特異性免疫，但顯然消化道惡性腫瘤患者對(duì)免疫治療的臨床反應(yīng)卻微乎其微[12]。目前，研究人員正在試圖找尋有助于克服腫瘤免疫抑制且不干擾腫瘤直接免疫反應(yīng)激活的策略。越來(lái)越多的證據(jù)提示已經(jīng)較成熟的治療策略如放療、外科縮瘤術(shù)及化療可以成功地聯(lián)合免疫治療的方法[44-46]。吉西他濱目前用于治療不可切除的胰腺癌且不會(huì)導(dǎo)致免疫抑制。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谝认侔┬∈竽Ｐ蜕献C實(shí)了聯(lián)合吉西他濱可擴(kuò)大DC瘤苗接種的療效?；诖税l(fā)現(xiàn)，我們機(jī)構(gòu)啟動(dòng)了研究吉西他濱聯(lián)合自體DC瘤苗治療晚期胰腺癌的Ⅱ期試驗(yàn)。

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