苜蓿假盤菌分離方法及培養(yǎng)性狀比較研究

張君艷，陳本建

（1.甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741020；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

苜蓿假盤菌（Pseudopeziza medicaginis）是一種寄生性較強(qiáng)的病原菌，屬于子囊菌亞門假盤菌屬，可引發(fā)紫花苜蓿、三葉草、草木樨等多種豆科植物發(fā)生褐斑病［1］，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，大量葉片從植株下部脫落，落葉率達(dá)50%以上，嚴(yán)重影響病株光合產(chǎn)物的積累，削弱生活力，影響抗逆性和越冬能力［2］。在新疆，苜蓿種植歷史久，面積大，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中有相當(dāng)重要的地位［3］，但品質(zhì)和產(chǎn)量同樣受到苜蓿假盤菌的威脅。袁慶華等［4］對北京菌株，王薊花等［5］對寧夏菌株，史娟等［6］對寧夏菌株進(jìn)行了苜蓿假盤菌生物學(xué)特性和適宜培養(yǎng)基等方面的研究。但是，據(jù)報(bào)道［1］，該菌是一種易發(fā)生變異的真菌，且該病菌致病力在地理上存在分化現(xiàn)象。因此，新疆對南、北疆菌株的培養(yǎng)特性做了研究，旨在尋找二者的聯(lián)系與區(qū)別，為以后的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種 苜蓿假盤菌分離自新疆北疆（烏魯木齊）和南疆（阿克蘇）苜蓿褐斑病的標(biāo)本，寄主為新疆大葉苜蓿（Medieago sativa）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 ①V－8培養(yǎng)基（V－8汁200mL，為美國進(jìn)口V－8蔬菜汁過濾所得，下同；蒸餾水800 mL）；②V－8苜蓿汁培養(yǎng)基（苜蓿汁800mL，取新鮮幼嫩健康的苜蓿葉片80g，清洗干凈，加蒸餾水800mL煮15min，過濾后補(bǔ)足800mL，下同；V－8汁200 mL）；③V－8碳酸鈣培養(yǎng)基（V－8汁200mL，CaCO32g，蒸餾水800mL）；④V－8碳酸鈣苜蓿汁培養(yǎng)基（V－8汁200mL，CaCO32g，苜蓿汁800mL）；①～④中分別加入瓊脂17g，制備為固體培養(yǎng)基，調(diào)整pH值為5.5，在121℃下滅菌30min。

1.2 研究方法

1.2.1 病原菌分離方法 離心稀釋分離法［4］：各自選取子囊盤成熟極好的病葉，用無菌水沖洗數(shù)次，再用75%酒精浸泡3min，隨后用無菌水沖洗，再用解剖刀切成小塊，裝入離心管，加少量無菌水，將病組織搗碎，8 000r/min速度下再離心5min，去上清液，反復(fù)3次。將處理好的分離沉積物用少量無菌水稀釋，用d＝1.5mm毛細(xì)管吸取一定量的分離物，移到載玻片上的水瓊脂上。在顯微鏡下用d＝0.2mm玻璃針挑取成熟子囊盤，轉(zhuǎn)入V－8碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基上，用封口膜將培養(yǎng)皿封好后放入20℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30d。此外，室內(nèi)要保持清潔，溫度30℃。

葉面彈射法：挑選子囊盤成熟較好的葉片，用無菌水清洗干凈后用0.1%升汞浸泡15s，再用無菌水反復(fù)清洗后保濕，葉面朝上平鋪于培養(yǎng)皿頂蓋中，并倒扣在V－8碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行彈射，密閉，放入20℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30d。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 選取分離后在V－8碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基上生長30d的菌落，置于小燒杯中，加入無菌水2mL，用鑷子將其充分搗碎，40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，有大量子囊和子囊孢子的即為孢子懸浮液（孢子濃度為3.0×105～1.5×106個(gè)/mL）。

1.2.3 培養(yǎng)基對菌落形態(tài)的影響 用移液槍吸取南疆菌株的孢子懸浮液（孢子濃度為3.0×105～1.5×106個(gè)/mL）0.5mL，接種于4種供試培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)30d。隨機(jī)確定要觀察的菌落10個(gè)，分別在生長的第5、9、13、17、21d和第30d觀察菌落顏色、質(zhì)地、外部形態(tài)、個(gè)數(shù)、成熟度，并用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑（精確到0.01mm），重復(fù)5次，由此計(jì)算菌落生長速度（菌落平均直徑與生長天數(shù)的比值）和菌落成熟率（菌落正面白色絨狀物褪去的個(gè)數(shù)與總個(gè)數(shù)的比值［4］）。分離形成菌落所需時(shí)間是指取少量離心稀釋法制備的菌液，置載玻片上，在顯微鏡下找到成熟子囊盤，并將其挑入培養(yǎng)基，從此時(shí)開始到長出肉眼可見的菌落為止所需天數(shù)，重復(fù)5次。

1.2.4 病原菌形態(tài)觀察 將2種菌株的定量孢子懸浮液接種在V－8碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基上，菌落成熟之后，用d＝1.5mm的毛細(xì)管挑取少量的子實(shí)體在40倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)子囊盤及子囊孢子的大小，重復(fù)5次。觀察時(shí)先將目鏡測微尺與鏡臺測微尺進(jìn)行校準(zhǔn)，再確定目鏡測微尺的實(shí)際測量值［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離方法

利用離心稀釋法，能夠使苜蓿假盤菌在培養(yǎng)基上生長并形成菌落，而在葉片彈射法實(shí)驗(yàn)中，雖然觀察到在病斑保濕24h之后就有孢子彈射和孢子萌發(fā)的情況，但最終未見菌落形成。

2.2 培養(yǎng)基對菌落形態(tài)的影響

相同培養(yǎng)條件下，南疆菌株在4種培養(yǎng)基上均能形成純化菌落，但培養(yǎng)性狀有明顯不同（表1），首先，菌落顏色基本出現(xiàn)2種情況：1）褐色或黑褐色；2）灰白色，前者菌落數(shù)量較多，直徑較大，生長速度較快，子囊盤成熟率也較好，分布較為疏松。其次，生長速度也存在一定差異，雖然均表現(xiàn)為前期較慢（10d之前），生長中期（第14～17d）為快速生長期，到后期（21～30d）趨于穩(wěn)定，即在整個(gè)生長時(shí)期表現(xiàn)為慢－快－慢的生長趨勢。但在V－8苜蓿汁培養(yǎng)基上的生長速度各個(gè)時(shí)期都相對最快（圖1）。

圖1 南疆菌株在4種培養(yǎng)基上的生長曲線Fig.1 Growth curve of Nanjiang strains of Pseudopeziza medicaginisin four culture meadiums

綜合生長速度、菌落量、子囊盤成熟率等各個(gè)因素，認(rèn)為V－8苜蓿汁培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果最好，它包含V－8汁和苜蓿煎汁兩方面的營養(yǎng)，能夠提供苜蓿假盤菌生長所需的養(yǎng)分。

2.3 不同菌株的菌落特征及病原菌形態(tài)

不同地理源的菌株在相同培養(yǎng)基上，菌落外觀表現(xiàn)有一定差別（表2和圖2A1、B1），表現(xiàn)在分離形成菌落所需時(shí)間上具有明顯的差異，南疆菌株最快需要12d，而北疆菌株則需要16d，但平均生長速度之間二者不存在顯著差異，都在0.05mm/d以下。

不同菌株病原菌的培養(yǎng)特征也有一定差別（表2和圖2A2、B2），主要表現(xiàn)在子囊盤大小之間，南疆菌株子囊盤模糊，有趨于脫落的現(xiàn)象，但孢子數(shù)量相對較多；北疆菌株有時(shí)會出現(xiàn)只有子囊盤，而沒有子囊孢子的現(xiàn)象，但子囊孢子大小之間二者并不存在顯著差異。

3 討論與結(jié)論

（1）在分離實(shí)驗(yàn)中得到，離心稀釋法為苜蓿假盤菌較適宜的分離方法，而史娟等［5］的結(jié)果表明常規(guī)組織塊分離法是最適宜的分離方法。這可能是由于供試菌株成熟度不一致所致，經(jīng)筆者仔細(xì)觀察，發(fā)現(xiàn)只有在苜蓿褐斑病發(fā)病葉片上病斑突起程度好（用手觸摸能感覺到明顯的突起），色澤呈黑褐色時(shí)，子囊盤成熟較好，才能用常規(guī)的組織塊分離，否則只能用離心稀釋法。

表1 苜蓿假盤菌南疆菌株在4種培養(yǎng)基上的特征Table 1 Characters of Nanjiang Strains of Pseudopeziza medicaginis in four culture meadiums

圖2 南疆、北疆菌株培養(yǎng)后期的菌落形態(tài)、子囊盤及子囊孢子Fig.2 Colonial morphology，apothecium and ascospone of Nanjiang Strains and Beijiang Strains of Pseudopeziza medicaginis at the later culturing stage

表2 南疆和北疆菌株菌落顏色變化、生長速度、子囊盤及子囊孢子的對比Table 2 Comparision on the colony color changes，growth speed，apothecium and ascospone of Nanjiang Strains and Beijiang Strains of Pseudopeziza medicaginis

（2）在培養(yǎng)基對菌落形態(tài)影響實(shí)驗(yàn)中得到，V－8苜蓿汁培養(yǎng)基最適合菌落的生長和繁殖。分析認(rèn)為苜蓿假盤菌既然能在苜?；铙w枝條上生長，那么苜蓿汁提供的營養(yǎng)對于假盤菌培養(yǎng)則是相當(dāng)必要的。史娟等［5］研究發(fā)現(xiàn)苜蓿假盤菌最適宜生長在番茄培養(yǎng)基和V－8碳酸鈣培養(yǎng)基上。袁慶華［3］也發(fā)現(xiàn)苜蓿假盤菌適宜生長和繁殖的培養(yǎng)基為V－8碳酸鈣培養(yǎng)基，而本實(shí)驗(yàn)則是以前人的研究結(jié)論為基礎(chǔ)，將已篩選出的適宜培養(yǎng)基做相應(yīng)的改變（其中番茄汁由進(jìn)口V－8蔬菜汁的過濾汁液代替），配合苜蓿汁液得出4種培養(yǎng)基，分別是V－8碳酸鈣、V－8碳酸鈣苜蓿汁、V－8苜蓿汁和 V－8培養(yǎng)基，再接種南疆菌株得出以上結(jié)論，所以V－8苜蓿汁培養(yǎng)基更適合苜蓿假盤菌南疆菌株的生長和繁殖，并且V－8蔬菜汁也價(jià)格便宜，使用方便，成本相對較低。

（3）不同地理來源的南、北疆菌株，菌落外觀（顏色、大小等）不同，首先表現(xiàn)在分離形成菌落的時(shí)間上，并且，分離的菌落成熟后（分離培養(yǎng)30d），自動(dòng)在其周圍彈射出子囊孢子，然后再形成肉眼可見新菌落，但形成時(shí)間也同樣存在明顯不同，南疆菌株（平均培養(yǎng)45 d）明顯快于北疆菌株（平均培養(yǎng)55d），這可能和不同來源菌株侵染寄主能力的強(qiáng)弱有關(guān)。苜蓿假盤菌的侵染能力的研究國內(nèi)外較少，針對不同來源的菌株對寄主侵染能力的研究還沒能深入，以后有待加強(qiáng)。其次，二者子囊盤大小上存在一定差異，可能與菌落（病斑）成熟度有關(guān)，成熟度越好，子囊盤越大。而子囊盤成熟度和寄主所處的環(huán)境條件（溫度、濕度、光照等）有關(guān)，和地理位置之間應(yīng)該沒有必然的聯(lián)系。并且不同來源的菌株子囊盤大小之間存在的差異不會體現(xiàn)在子囊孢子的大小上。

（4）北疆菌株有時(shí)會出現(xiàn)有子囊盤，但沒有子囊孢子的現(xiàn)象，可能是這一菌株處于其無性時(shí)代，但依然沒有足夠的證據(jù)說明，而前人研究表明［5，8］，該菌自然條件下未見無性態(tài)，培養(yǎng)條件下產(chǎn)生大量分生孢子結(jié)構(gòu)，但該結(jié)構(gòu)并不侵染寄主，關(guān)于苜蓿假盤菌無性世代說法，以及無性時(shí)代的存在與侵染能力、致病能力等方面有無必然聯(lián)系，有待進(jìn)一步的研究。

（5）苜蓿褐斑病對苜蓿產(chǎn)量的影響不亞于蟲害［9］、水分、養(yǎng)分［10］等對其產(chǎn)量［11］的威脅，所以深入研究褐斑病致病菌的生物學(xué)特性和培養(yǎng)性狀對苜?？共∮N有很大的貢獻(xiàn)。在對苜蓿假盤菌的認(rèn)識過程中，以后還需在不同來源菌株致病能力研究、人工培養(yǎng)條件下假盤菌致病能力分化、菌株?duì)I養(yǎng)體親和性等方面做更深入研究，以便更好的預(yù)防和治理。

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