雷公藤多苷對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、骨形成蛋白7及Gremlin表達(dá)的影響

張 燕 常保超 陳衛(wèi)東

目前，糖尿病腎病(DN)導(dǎo)致慢性腎衰竭已十分常見(jiàn)，其病理改變多表現(xiàn)為彌漫性腎小球硬化、腎小球結(jié)節(jié)性硬化，腎間質(zhì)纖維化等。與腎小球病變相比，腎間質(zhì)纖維化更能反映腎功能減退的程度，決定患者預(yù)后［1］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(TGF－β1)是重要的促纖維化因子，拮抗TGF－β1的抗纖維化因子骨形成蛋白 7(BMP－7)及 BMP－7的內(nèi)源性拮抗劑Gremlin在體內(nèi)失衡是引起腎間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制。雷公藤多苷(TW)因具有獨(dú)特的抗炎作用被應(yīng)用于臨床治療DN，但其是否具有抗纖維化作用研究較少。本研究通過(guò)高糖高脂飲食，并以鏈脲佐菌素腹腔注射建立DN大鼠模型，觀察腎組織損傷過(guò)程中 TGF－β1、BMP－7 及 Gremlin 的表達(dá)變化，進(jìn)一步了解DN腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，應(yīng)用TW進(jìn)行干預(yù)治療，以探討其在防治腎間質(zhì)纖維化的作用。

對(duì)象與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體重180～200g(購(gòu)自蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(30只)及對(duì)照組(10只)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，測(cè)鼠重進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。造模組予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素;對(duì)照組予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，腹腔注射枸橡酸鹽緩沖液。72h后采血測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。將成功造模的26只大鼠隨機(jī)分為DN組13只，每日以生理鹽水灌胃;TW治療組13只，每日以TW 50 mg/(kg·d)灌胃，用藥16周。

主要試劑 兔抗大鼠TGF－β1多克隆抗體、兔抗大鼠BMP－7多克隆抗體、兔抗大鼠Gremlin多克隆抗體、羊抗兔二抗均購(gòu)自北京奧博森生物技術(shù)有限公司。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物均購(gòu)自上海生物工程公司。TW片劑由上海藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

觀察方法

一般情況 每天觀察各組大鼠精神、飲食、飲水、皮毛色澤及活動(dòng)情況。

尿蛋白定量及尿N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶(NAG) 在造模前及造模后第2、4、8、16周測(cè)量鼠重，并將大鼠放入代謝籠中，禁食、自由飲水，收集24h尿。免疫比濁法測(cè)定24h尿蛋白定量，用分光光度法測(cè)量尿NAG。

血清生化、腎組織的采集及檢驗(yàn) 16周處死動(dòng)物，處死時(shí)心臟采血3 ml用于生化檢驗(yàn)。取血后，摘取腎臟，右腎生理鹽水洗去血跡后稱(chēng)重，液氮速凍后－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。左腎放入10%中性甲醛中固定備檢。氧化酶法測(cè)定血糖，采取自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清白蛋白(Alb)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)。

腎組織病理檢查 (1)組織學(xué):將10%中性甲醛固定的腎組織石蠟包埋的常規(guī)組織切片，HE染色，觀察腎組織病理變化。腎間質(zhì)纖維化定量分析借助HMIAS－2000高清彩色病理報(bào)告分析系統(tǒng)，每個(gè)標(biāo)本在光鏡200倍視野下分別觀察10個(gè)不含腎小球的皮質(zhì)視野。計(jì)算纖維化面積占整個(gè)視野的百分比。腎間質(zhì)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)在400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)不含腎小球的視野，計(jì)數(shù)腎間質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)，結(jié)果以(炎癥細(xì)胞數(shù)/高倍視野×400)表示［2］。(2)免疫組織化學(xué)染色:常規(guī)脫蠟，3%H2O2處理，微波修復(fù)抗原后滴加封閉液，滴加兔抗大鼠TGF－β1多克隆抗體、兔抗大鼠 BMP－7多克隆抗體、兔抗大鼠Gremlin多克隆抗體。次日加生物素化，山羊抗兔IG在37℃孵育30 min，加SABC工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照組以PBS緩沖液代替一抗。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)抽取10個(gè)高倍視野下，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

腎組織 TGF－β1、BMP－7、Gremlin 核酸表達(dá) 以RT－PCR 檢測(cè) TGF－β1、BMP－7、Gremlin 核酸表達(dá)。取各組大鼠腎皮質(zhì)0.1g，用TRIzol抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度及純度(A260/280值在 180～200之間)。取 5 μg總 RNA，按照M－MLV Reverse Transcriptuse試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA，取適量CDNA在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為50 μl。MNCBI的Nucleotide中查得目的基因和內(nèi)參照基因，采取Primer Express Sofware設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。

TGF－β1:上游 5＇－GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA－3＇，下游 ＇5＇－GAAGCGAAAGCCCTGTATTCC－3＇。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度242 bp;擴(kuò)增條件為94℃度預(yù)變性2 min，94℃變性 30s，54℃退火 30s，72℃延伸 40s，經(jīng) 30 個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸8 min。

BMP－7:上游 5＇GTAGCGCGTAGAGCCG－3＇，下游＇5＇－CGAGTCCGTGCATGG－3＇。擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度 345 bp，擴(kuò)增條件為94℃度預(yù)變性2 min，94℃變性30s，57.1℃退火30s 72℃延伸40s，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后72℃再延伸8 min。

Gremlin:上游 5＇－AGGTTCCCAAGGAGCCATTC－3＇，下游 ＇5＇－GATATGCAACGGCACTGCTT－3＇。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度275 bp，擴(kuò)增條件為94℃度預(yù)變性2 min，94℃變性 30s，61℃退火 30s，72℃延伸 40s，經(jīng) 30 個(gè)循環(huán)后72℃再延伸8 min。

內(nèi)參 GAPDH:上游 5＇－GAGAGGGAAATCGTGCG TGAC－3＇，下 游 ＇5＇－CATCTGCTGGAAGGTGGACA－3＇。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度453 bp，擴(kuò)增條件為94℃度預(yù)變性2 min，94℃變性30s，57.1℃退火30s，72℃延伸40s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后72℃再延伸8 min。

取PCR產(chǎn)物5 μl與上樣緩沖液充分混勻后，于5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線(xiàn)透射檢測(cè)儀上，在紫外燈下照相，再以L(fǎng)abworks軟件進(jìn)行光密度掃描。以甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)密度作為參考值標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，比值表示核酸相對(duì)表達(dá)量。

腎組織 TGF－β1、BMP－7、Gremlin 蛋白表達(dá) 以Western blotting 檢測(cè)腎組織 TGF－β1、BMP－7、Gremlin蛋白表達(dá)，將腎組織加入裂解液中，提取總蛋白后，測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣本在100℃變性5 min，各取樣本20 μl，進(jìn)行 SDS－PAGE 凝膠電泳。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1h。加入兔抗大鼠多克隆抗體TGF－β1(1∶100)、兔抗大鼠多克隆抗體BMP－7(1∶200)和兔抗大鼠多克隆抗體Gremlin(1∶200)，4℃過(guò)夜，洗膜后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃下孵育1h。取出PVDF膜，置于DAB顯色液顯色、定影。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶光密度掃描分析，以靶蛋白條帶光密度與內(nèi)參照條帶光密度的比值作為蛋白的各組相對(duì)表達(dá)量，予以統(tǒng)計(jì)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(ˉx±s)表示，尿蛋白定量和尿NAG在三組間和造模前后不同時(shí)間點(diǎn)變化的比較采用兩因素多水平重復(fù)測(cè)量資料的方差分析;其他指標(biāo)的平均水平及腎組織病理改變?cè)谌M間的比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗(yàn);采用Pearson直線(xiàn)相關(guān)分析腎組織TGF－β1與Gremlin表達(dá)的關(guān)系。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組30只大鼠中2只造模失敗，2只因血糖過(guò)高死亡，共26只進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，后因感染死亡3只。最終進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析的大鼠DN組11只，TW組12只，對(duì)照組10只。DN模型組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，食欲下降、體重減輕，毛發(fā)雜亂無(wú)光澤。TW干預(yù)后上述情況有所改善，第16周TW組大鼠體重(416.35±72.26)g與DN組(388.26±53.07)g及對(duì)照組(543.23±36.92)g比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

各組大鼠尿蛋白、尿NAG比較 在鏈脲佐菌素腹腔注射2周后模型組動(dòng)物尿蛋白增加，至4周達(dá)到頂峰，此后一直保持較高水平，兩組大鼠尿蛋白變化趨勢(shì)基本一致，但TW組低于DN組，在第4、8、16周時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)(表1)。DN組及TW組早期出現(xiàn)尿NAG升高，與對(duì)照組比較在第2、4、8、16周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;TW組尿NAG水平顯著低于DN組(P＜0.01)(表2)。

各組生化指標(biāo)改變見(jiàn)表3，第16周時(shí)與正常對(duì)照組相比，模型組隨機(jī)血糖、SCr、BUN明顯升高，Alb降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。TW組SCr和BUN顯著低于DN組(P＜0.01)，Alb顯著高于后組(P＜0.01)。

腎組織病理改變 對(duì)照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常;DN組腎小球面積和腎小球體積增大，腎小球毛細(xì)血管袢基膜增厚，系膜區(qū)系膜細(xì)胞增多、基質(zhì)增生，部分大鼠出現(xiàn)局灶腎小球硬化性改變;腎小管上皮細(xì)胞渾濁、空泡樣變，部分上皮細(xì)胞壞死，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織增生，局灶性纖維化。TW組較DN組病變輕，部分腎小球毛細(xì)血管袢基膜增厚，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化較少(P＜0.01)(表4)。

表1 各組大鼠尿蛋白定量(mg/24h)的變化

表2 各組大鼠尿NAG(U/L)變化

表3 第16周各組實(shí)驗(yàn)大鼠血糖生化指標(biāo)的變化

表4 各組腎組織病理的改變

腎組織 TGF－β1、BMP－7 和 Gremlin 免疫組化及蛋白的表達(dá) 16周時(shí)，TGF－β1、Gremlin在對(duì)照組腎小管有少量表達(dá)，均呈胞漿陽(yáng)性;DN組及TW組腎小管 TGF－β1、Gremlin的表達(dá)明顯增加(P ＜0.01)。與DN組比較，TW組的兩者表達(dá)量下降(P＜0.01)。Western blotting法檢測(cè)腎組織 TGF－β1、Gremlin的蛋白表達(dá)也顯示同樣的變化趨勢(shì)(P ＜0.01)(表5、6，圖 1、2)。

各組腎組織均有BMP－7表達(dá)，主要位于腎小管和集合管，呈胞質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性，DN組及TW組BMP－7的表達(dá)低于對(duì)照組。與DN組相比，TW組BMP－7表達(dá)增多(P＜0.01)。Western blotting法檢測(cè)腎組織BMP－7的蛋白表達(dá)，與對(duì)照組比較DN組明顯下調(diào)，TW干預(yù)后BMP－7 蛋白增加(P ＜0.01)(表5、6，圖1、2)。

腎組織 TGF－β1、BMP－7 和 Gremlin 的核酸表達(dá)與對(duì)照組比較，DN組和TW組腎組織TGF－β1和Gremlin核酸表達(dá)上調(diào)，但 TW組低于 DN組(P＜0.01)。與對(duì)照組比較，DN組和TW組BMP－7核酸表達(dá)下調(diào)，但TW組高于DN組(P＜0.01)(表7、圖 3)。

腎組織TGF－β1與Gremlin表達(dá)的關(guān)系 兩者在免疫組化、核酸和蛋白表達(dá)的相關(guān)系數(shù)r分別為0.898、0.648和0.855，說(shuō)明兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(P ＜0.01)。

表5 腎組織免疫組化TGF-β1、BMP-7和Gremlin陽(yáng)性細(xì)胞百分比(%)

表6 腎組織TGF-β1、BMP-7和Gremlin蛋白的表達(dá)

表7 腎組織TGF-β1、BMP-7和Gremlin的核酸表達(dá)

圖1 糖尿病腎病組、雷公藤多苷治療組及對(duì)照組大鼠16周腎組織形態(tài)學(xué)變化及 TGF-β1、BMP-7和Gremlin表達(dá)

圖2 各組大鼠腎組織 TGF-β1、BMP-7和 Gremlin的蛋白表達(dá)

圖3 各組大鼠腎組織 TGF-β1、BMP-7和 Gremlin的核酸表達(dá)

討 論

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎病的共同結(jié)果。蛋白尿是DN腎小球損傷的標(biāo)志，同時(shí)也是加重腎臟損害的因素［3］。Morii等［4］研究發(fā)現(xiàn)，蛋白尿在腎小管損傷方面發(fā)揮了更加重要的作用。進(jìn)入腎小管中的蛋白質(zhì)及前免疫介質(zhì)加重腎小管上皮細(xì)胞負(fù)荷并促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞釋放各種炎癥因子、趨化因子［如單核細(xì)胞趨化因子1(MCP－1)］等，使腎間質(zhì)單核/巨噬聚集、導(dǎo)致小管間質(zhì)炎性反應(yīng)。刺激原基質(zhì)成纖維細(xì)胞和經(jīng)上皮間葉轉(zhuǎn)化來(lái)的肌纖維細(xì)胞增生，腎間質(zhì)纖維化［5，6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，DN早期大鼠尿蛋白定量增加，腎小管上皮細(xì)胞受損，尿NAG升高，并隨病程進(jìn)展加重，16周時(shí)可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞渾濁、空泡樣變和壞死，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。既往體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷公藤甲素可穩(wěn)定足細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞的損傷，恢復(fù)足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和相關(guān)分子的表達(dá)，從而減少尿蛋白［7］。雷公藤具有抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞凋亡，抑制IL－1α、IL－1β、MCP－1 等炎癥因子的合成，抑制腎小管上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生等廣泛抗炎、抑制免疫作用，本研究中經(jīng)TW干預(yù)后，大鼠尿蛋白明顯減少，尿NAG下降，病理顯示腎小管損害減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，說(shuō)明TW可以減輕尿蛋白，改善腎小管的損傷，抑制炎癥，從而改善腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生及發(fā)展。

細(xì)胞因子與DN腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化密切相關(guān)。TGF－β1是纖維化的中心環(huán)節(jié)，參與成纖維細(xì)胞的活化、增生和表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)增多的過(guò)程［8］。BMP－7是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的一員，它調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、趨化及凋亡。能夠阻斷TGF－β1信號(hào)，逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)［9］，誘導(dǎo)間質(zhì)成纖維細(xì)胞向上皮細(xì)胞分化(MET)［10］，拮抗 TGF－β1 誘導(dǎo)的間質(zhì)成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化成α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－SMA)的肌成纖維細(xì)胞［11］，逆轉(zhuǎn) TGF－β1 的促纖維化作用。在DN早期高糖、尿蛋白、多種細(xì)胞因子的作用下，腎組織TGF－β1/Smad2/3促纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活［12，13］，BMP－7 的表達(dá)下降，與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。外源性重組BMP－7能夠改善腎小管間質(zhì)纖維化，并與劑量正相關(guān)［14］。

我們觀察16周DN大鼠腎組織TGF－β1的免疫組化、核酸及蛋白表達(dá)異常增高，BMP－7的免疫組化、核酸及蛋白表達(dá)下降，腎間質(zhì)纖維結(jié)蹄組織增生明顯、局灶纖維化。DN發(fā)生發(fā)展過(guò)程中不僅高血糖、高血脂等代謝因素促進(jìn)腎組織TGF－β1的表達(dá)，炎癥趨化因子MCP－1使得單核巨噬細(xì)胞在局部浸潤(rùn)增生，進(jìn)一步促進(jìn) TGF－β1的高表達(dá)［15］。而雷公藤作為一種免疫抑制劑，很低濃度的雷公藤甲素即能抑制脂多糖(LPS)刺激的樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生MCP－1的生成［16］，抑制腎小管上皮細(xì)胞的抗原遞呈功能［17］，抑制腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)MCP－1［18］，從而起到減少TGF－β1的產(chǎn)生，基于上述的研究結(jié)果，我們采用TW干預(yù)。治療后TGF－β1的免疫組化、核酸及蛋白表達(dá)增高趨勢(shì)被抑制，BMP－7核酸、蛋白增加，腎組織纖維化減輕。說(shuō)明TWP能夠下調(diào)TGF－β1表達(dá)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，上調(diào)BMP－7的表達(dá)，從而改善腎間質(zhì)纖維化。

BMP－7的腎臟保護(hù)作用，不僅取決于其本身，還與其激動(dòng)劑和拮抗劑之間的復(fù)雜平衡有關(guān)［19］。TGF－β1和BMP－7在腎纖維化的過(guò)程中相互拮抗，但TGF－β1并非 BMP－7受體的配體，本身不調(diào)節(jié)BMP－7表達(dá)及信號(hào)傳導(dǎo)，而是通過(guò)正向調(diào)節(jié)其下游因子 BMP－7的內(nèi)源性拮抗劑 Gremlin發(fā)揮作用的［20，21］。研究發(fā)現(xiàn)Gremlin在 DN 腎組織表達(dá)是增加的，并與腎間質(zhì)纖維化及腎功能減退相關(guān)［22，23］。外源性端粒酶抑制Gremlin表達(dá)可以減輕腎間質(zhì)纖維化［24］。

我們還發(fā)現(xiàn)，DN腎組織Gremlin的核酸及蛋白表達(dá)明顯升高，且主要在腎小管表達(dá)，與TGF－β1的表達(dá)具有正相關(guān)性，這說(shuō)明TGF－β1可以正向調(diào)節(jié)Gremlin的表達(dá)。DN發(fā)展過(guò)程中過(guò)度表達(dá)的TGF－β1上調(diào)Gremlin的產(chǎn)生，拮抗BMP－7的抗纖維化，而TW抑制TGF－β1的產(chǎn)生，從而下調(diào)Gremlin了的表達(dá)，改善腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，本研究闡明了TW通過(guò)減少蛋白尿、保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞、抑制炎癥，下調(diào)促纖維化因子TGF－β1及下游因子Gremlin的表達(dá)，上調(diào)抗纖維化因子BMP－7的表達(dá)，從而改善腎間質(zhì)纖維化。但是，Gremlin并不調(diào)節(jié)BMP－7的產(chǎn)生，因此TW增加BMP－7表達(dá)機(jī)制的研究有待進(jìn)一步完善。

1 Klahr S，Morrissey J，Hruska K，et al.New approaches to delay the progression ofchronic renalfailure.Kidney Int，2002，Suppl(80):23－26.

2 Taal MW，Zandi－Nejad K，Weening B，et al.Proinflammatory gene expression and macrophage recruitment in the rat remnant kidney.Kidney Int，2000，58(4):1664 －1676.

3 徐鵬杰，李 航，徐亞蘭，等.2型糖尿病倂發(fā)慢性腎臟病臨床病理分析.中華腎臟病雜志，2010，26(10):731－735.

4 Morii T，F(xiàn)ujitaH，NaritaT，etal. Association ofmonocyte chemoattractant protein－1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy.J Diabetes Complications，2003，17(1):11 － 15.

5 Wang Y，Chen J，Chen L，et al.Induction of monocyte chemoattractant protein－1 in proximal tubule cells by urinary protein.J Am Soc Nephrol，1997，8(10):1537 －1545.

6 Donadelli R，Zanchi C，Morigi M，et al.Protein overload induces fractalkine upregulation in proximal tubular cells through nuclear factor kappaB－and p38 mitogen－activated protein kinase－dependent pathways.J Am Soc Nephrol，2003，14(10):2436 － 2446.

7 Zheng CX，Chen ZH，Zeng CH，et al.Triptolide protects podocytes from puromycin aminonucleoside induced injury in vivo and in vitro.Kidney Int，2008，74(5):596 －612.

8 Kelynack KJ，Hewitson TD，Martic M，et al.Lovastatin downregulates renal myofibroblast function in vitro. Nephron， 2002， 91(4):701－707.

9 Yoshikawa M，Hishikawa K，Marumo T，et al.Inhibition of histone deacetylase activity suppresses epithelial－to－mesenchymal transition induced by TGF－beta1 in human renal epithelial cells.J Am Soc Nephrol，2007，18(1):58 －65.

10 Zeisberg M，Shah AA，Kalluri R.Bone morphogenic protein－7 induces mesenchymal to epithelial transition in adult renal fibroblasts and facilitates regeneration of injured kidney.J Biol Chem，2005，280(9):8094－8100.

11 Veerasamy M，Nguyen TQ，Motazed R，et al.Differential regulation of E－cadherin and alpha－smooth muscle actin by BMP 7 in human renal proximal tubule epithelial cells and its implication in renal fibrosis.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(5):F1238 － F1248.

12 張飛飛，譚若云，熊明霞，等.高糖通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1－Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化.中華腎臟病雜志，2008，24(3):174－178.

13 Liu Y.Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics.Kidney Int，2006，69(2):213 － 217.

14 Wang SN，Lapage J，Hirschberg R.Loss of tubular bone morphogenetic protein－7 in diabetic nephropathy.J Am Soc Nephrol，2001，12(11):2392－2399.

15 劉 娜，嚴(yán)海東，李雪竹，等.單核細(xì)胞趨化蛋白1在人腎小管細(xì)胞分化中的作用及其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子表達(dá)的關(guān)系.中華腎臟病雜志，2008，24(8):586 －587.

16 Liu Q，Chen T，Chen G，et al，Immunosuppressant triptolide inhibits dendritic cell－mediated chemoattraction of neutrophils and T cells through inhibiting Stat3 phosphorylation and NF－kappaB activation.Biochem Biophys Res Commun，2006，345(3):1122 －1130.

17 李 恒，劉志紅.雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞抗原遞呈功能的影響.腎臟病與透析腎移植雜志，2001，10(4):303－308.

18 劉志紅，戴春筍，李恒，等.雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞單核細(xì)胞趨化因子合成的影響.腎臟病與透析腎移植雜志，2000，9(5):431 －435.

19 Yanagita M.Modulator of bone morphogenetic protein activity in the progression of kidney diseases.Kidney Int.2006，70(6):989 －993.

20 Tardif G，Hum D，Pelletier JP，et al.Differential gene expression and regulation of the bone morphogenetic protein antagonists follistatin and gremlin in normal and osteoarthritic human chondrocytes and synovial fibroblasts.Arthritis Rheum，2004，50(8):2521 －2530.

21 Kane R，Stevenson L，Godson C，et al.Gremlin gene expression in bovine retinal pericytes exposed to elevated glucose.Br J Ophthalmol，2005，89(12):1638 －1642.

22 McMahon R，Murphy M，Clarkson M，et al.IHG－2，a mesangial cell gene induced by high glucose，is human gremlin.Regulation by extracellular glucose concentration，cyclic mechanical strain，and transforming growth factor－beta1. J Biol Chem，2000， 275(14):9901－9904.

23 Dolan V，Murphy M，Sadlier D，et al.Expression of gremlin，a bone morphogenetic protein antagonist，in human diabetic nephropathy.Am J Kidney Dis，2005，45(6):1034 －1039.

24 Zhang Q，Shi Y，Wada J，et al.In vivo delivery of Gremlin siRNA plasmid reveals therapeutic potential against diabetic nephropathy by recoveringbone morphogenetic protein－7.PLoS One，2010，5(7):e11709.