胃癌組織Pokem on和p14ARF表達(dá)率及其在臨床生物學(xué)行為中的意義

賈 楠，劉月平，李 勇*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北石家莊 050011）

·論 著·

胃癌組織Pokem on和p14ARF表達(dá)率及其在臨床生物學(xué)行為中的意義

賈 楠1，劉月平2，李 勇1*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北石家莊 050011）

目的探討胃癌組織中Pokemon、p14ARF蛋白表達(dá)率及其與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系。方法取手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本50例，正常胃黏膜組織標(biāo)本20例，用免疫組織化學(xué)方法檢測胃癌組織、正常胃黏膜組織Pokemon和p14ARF蛋白的表達(dá)，并且分析二者表達(dá)情況與胃癌患者性別、年齡、腫瘤部位、瘤體大小、大體分型、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床生物學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果①在胃癌組織和正常胃黏膜組織中Pokemon和p14ARF均表達(dá)于細(xì)胞核，在陽性染色的細(xì)胞核中呈現(xiàn)棕黃色顆粒。Pokemon蛋白表達(dá)率在胃癌組織中為78%，在正常胃黏膜組織中為45%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。p14ARF蛋白表達(dá)率在胃癌組織中為42%，在正常胃黏膜組織為90%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②胃癌組織中Pokemon蛋白表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為87.5%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為40%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著腫瘤增大、浸潤程度加深及臨床分期升高，胃癌組織中Pokemon蛋白表達(dá)有升高趨勢(shì)。③胃癌組織中p14ARF蛋白表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為37.5%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為80%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著腫瘤分化程度的降低、浸潤程度的加深及臨床分期的升高，胃癌組織中p14ARF蛋白表達(dá)有降低的趨勢(shì)。④胃癌組織中，Pokemon與p14ARF蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.280，P=0.049）。結(jié)論胃癌組織Pokemon高表達(dá)和p14ARF低表達(dá)可反映胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等臨床生物學(xué)行為的程度。

胃腫瘤；Pokemon蛋白；腫瘤抑制蛋白質(zhì)；p14ARF

胃癌是人類最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。胃癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸是一個(gè)機(jī)制復(fù)雜的過程，其中分子生物學(xué)機(jī)制主要有癌基因激活和抑癌基因失活。Pokemon基因（POK erythroid ontogenic factor）為原癌基因，在細(xì)胞分化過程中具有多效性功能。該基因通過抑制某些抑癌基因，致細(xì)胞內(nèi)抑制機(jī)制缺陷和細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而發(fā)生腫瘤［1］?？勺冮喿x框（alternative reading frame，ARF）基因通過編碼p14ARF腫瘤抑制蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控和p53途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤形成［2］。本研究采用免疫組織化學(xué)法（streptavidin peroxidase，SP）檢測胃癌組織及正常胃黏膜組織中Pokemon和p14ARF蛋白的表達(dá)及其在臨床生物學(xué)行為中的作用，以探討Pokemon和p14ARF在胃癌發(fā)生與轉(zhuǎn)歸中的意義，為胃癌臨床分子生物學(xué)分期、預(yù)后及指導(dǎo)綜合治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科2006年10月—2009年8月接受手術(shù)切除治療的胃癌組織標(biāo)本50例，其中男性38例，女性12例；＜50歲者12例，≥50歲者38例，年齡37～75歲，中位年齡56歲。腫瘤位于賁門與胃底部7例，胃體部20例，胃竇部23例；直徑＜5.0cm者25例，≥5.0cm者25例；局限型（BorrmannⅠ、Ⅱ）24例，浸潤型（BorrmannⅢ、Ⅳ）26例；高和中分化腺癌21例，低分化腺癌29例；浸潤深度為T1+T2 9例，T3+T4 41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10例；臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期9例，Ⅲ+Ⅳ期41例。另取正常胃黏膜組織標(biāo)本20例（距癌灶邊緣＞5.0cm，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)無腫瘤細(xì)胞）作為對(duì)照組。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療和化療，其臨床記錄均按照“全國胃癌診治規(guī)范”［3］進(jìn)行登記。

1.2 試劑與方法：取手術(shù)切除的胃癌組織、正常胃黏膜組織標(biāo)本放入10%甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。用免疫組織化學(xué)SP法測定胃癌組織標(biāo)本中Pokemon和p14ARF。按試劑盒說明進(jìn)行（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。Pokemon一抗為兔抗人多克隆抗體（美國ProMab公司），p14ARF鼠抗人單克隆抗體（美國Cell Signaling公司），均購自河北海森生物技術(shù)開發(fā)有限公司。抗體的稀釋度為1∶200。以PBS代替第一抗體的胃癌組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果作陰性對(duì)照；試劑盒自帶陽性片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果作為陽性對(duì)照。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷：免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，光鏡下，Pokemon蛋白和p14ARF蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，以胞核中出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。參考Fromowitz陽性細(xì)胞半定量分級(jí)法，觀察整張切片，根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)計(jì)分，≤5%計(jì)0分，＞5%～25%計(jì)1分，＞25%～50%計(jì)2分，＞50%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分；再根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分，無著色計(jì)0分，淡黃計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；兩者積分相加所得的總分，按照0～1分為（-），2～3分為（+），4～5分為（++），6～7分為（+++）。以（-）和（+）定為低表達(dá)，（++）和（+++）定為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織及正常胃黏膜組織中Pokemon蛋白的表達(dá)：在胃癌組織和正常胃黏膜組織中Pokemon主要表達(dá)于細(xì)胞核，陽性染色的細(xì)胞核中呈現(xiàn)出棕黃色細(xì)顆粒（圖1）。胃癌組織中Pokemon蛋白表達(dá)39例（78%），正常胃黏膜組織中表達(dá)率（45%），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 Pokemon和p14ARF在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達(dá)Table 1 Expression of Pokemon and p14ARFin gastric carcinoma tissues and normal gastricmucosa

2.2 胃癌組織Pokemon蛋白表達(dá)及其在臨床生物學(xué)行為中的意義：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的胃癌組織中Pokemon蛋白表達(dá)率為87.5%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為40.0%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；胃癌組織Pokemon蛋白表達(dá)在患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、大體分型、分化程度、浸潤深度、臨床分期等因素間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是，Pokemon蛋白表達(dá)率隨著腫瘤的增大（直徑≥5.0cm組較直徑＜5.0cm組）、浸潤程度的加深（T3+T4組較T1+T2組）和臨床分期的升高（Ⅲ+Ⅳ期組較Ⅰ+Ⅱ期組）有升高趨勢(shì)，見表2。

2.3 胃癌組織及正常胃黏膜組織中p14ARF蛋白的表達(dá)：胃癌組織和正常胃黏膜組織中p14ARF蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞染色呈核內(nèi)棕黃色細(xì)顆粒狀（圖2）。胃癌組織中p14ARF蛋白表達(dá)率42%，正常胃黏膜組織90%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表2 胃癌組織中Pokemon表達(dá)與臨床組織病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation between the expression of Pokem on in gastric carcinoma tissues and clinical histopathologic characteristics

Body of stomach 20 18（90.0）2（10.0）1.828 0.176 Sinus ventriculi 23 17（739）6（26.1）0.719 0.397 Tumor diameter（L/cm）＜5 25 18（72.0）7（28.0）≥5 25 21（84.0）4（16.0）1.049 0.496 Typing Localized type 24 19（79.2）5（20.8）Infiltrating type 26 20（76.9）6（23.1）0.037 0.848 Differentiation High and Moderate 21 17（80.9）4（19.1）Low 29 22（79.3）7（20.7）0.007 0.741 Depth of invasion T1+T2 9 5（55.6）4（44.4）T3+T4 41 34（70.7）7（29.3）0.239 0.628 Lymph nodemetastasis Yes 40 35（87.5）5（12.5）No 10 4（40.0）6（60.0）7.933 0.004 Tumor stageⅠ～Ⅱ9 6（66.7）3（33.3）Ⅲ～Ⅳ41 33（80.5）8（19.5）0.214 0.392

2.4 胃癌組織p14ARF蛋白表達(dá)及其臨床生物學(xué)行為的意義：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的胃癌組織中p14ARF蛋白表達(dá)率為37.5%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為80.0%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胃癌組織中p14ARF蛋白表達(dá)在患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、大體分型、分化程度、浸潤深度、臨床分期等因素間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是，p14ARF蛋白表達(dá)率隨著分化程度的降低（低分化組較高和中分化組）、浸潤程度的加深（T3+T4組較T1+T2組）和臨床分期的升高（Ⅲ+Ⅳ期組較Ⅰ+Ⅱ期組）有降低趨勢(shì)，見表3。

表3 胃癌組織中p14ARF表達(dá)與臨床組織病理特征的關(guān)系Table 3 Correlation between the expression of p14ARFin gastric carcinoma tissues and clinical histopathologic characteristics

Typing Localized type 24 10（41.7）14（58.3）Infiltrating type 26 11（42.3）15（57.7）0.002 0.963 Differentiation High andmoderate 21 9（42.9）12（57.1）Low 29 12（41.4）17（58.6）0.011 1.000 Depth of invasion T1+T2 9 4（44.41）5（55.6）T3+T4 41 17（43.9）24（56.1）0.018 0.896 Lymph nodemetastasis Yes 40 13（37.5）27（62.5）No 10 8（80.0）2（20.0）4.147 0.042 Tumor stageⅠ～Ⅱ9 4（44.4）5（56.6）Ⅲ～Ⅳ41 17（43.9）24（56.1）0.044 0.716

2.5 胃癌組織中Pokemon與p14ARF蛋白表達(dá)的關(guān)系：胃癌組織中，Pokemon與p14ARF蛋白表達(dá)率呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.280，P=0.049），見表4。

表4 胃癌組織中Pokemon與p14ARF表達(dá)的相關(guān)性分析Table 4 Correlations between the exp ression of Pokemon and p14ARFin gastric carcinoma tissues

3 討 論

Pokemon蛋白是由ZBTB7基因編碼的具有584個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)［4］，在多種組織中都有表達(dá)。Morrison等［5］通過Northern Blot分析發(fā)現(xiàn)Pokemon mRNA表達(dá)于人外周血白細(xì)胞、結(jié)腸、小腸和卵巢，同時(shí)通過Western Blot分析還發(fā)現(xiàn)所有人類細(xì)胞系（包括HeLa、Jurkat、BJAB和Raji細(xì)胞）都存在Pokemon蛋白的表達(dá)。Davies等［6］發(fā)現(xiàn)人和鼠Pokemon基因廣泛表達(dá)于成熟組織和細(xì)胞系。乳腺癌T47D細(xì)胞系及成人皮膚組織中均存在Pokemon過表達(dá)［7］。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測Pokemon蛋白表達(dá)率為78%，正常胃黏膜組織表達(dá)率為45%，提示胃癌組織中存在Pokemon蛋白過度表達(dá)。Lee等［8］研究表明，Pokemon的痘病毒鋅指結(jié)構(gòu)域可與核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）-p65的Rel同源結(jié)構(gòu)域發(fā)生反應(yīng)，這種分子間的反應(yīng)能增加細(xì)胞核NF-κB的穩(wěn)定性，使NF-κB更長時(shí)間維持于核內(nèi)。而NF-κB的異常核內(nèi)激活與惡性腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，亦是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的胃癌組織中Pokemon蛋白表達(dá)率為87.5%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的為40.0%，提示Pokemon過表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。因此，推斷Pokemon可能增加了細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平并維持其穩(wěn)定性，使NF-κB作用其靶基因，從而通過相關(guān)機(jī)制促使胃癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

p14ARF功能失活可導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生［10］。胃癌組織p14ARF基因通常會(huì)發(fā)生變異，導(dǎo)致p14ARFmRNA及其蛋白無表達(dá)，從而加速細(xì)胞通過G1→S和G2→M調(diào)控點(diǎn)，使細(xì)胞呈無限制方式增殖生長，最終導(dǎo)致胃癌發(fā)生和發(fā)展［2］。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織p14ARF蛋白表達(dá)率為42%，正常胃黏膜組織為90%，證實(shí)p14ARF蛋白缺失是導(dǎo)致胃癌的發(fā)生的原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的胃癌組織中p14ARF蛋白表達(dá)率為37.5%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為80.0%。p14ARF蛋白表達(dá)率，隨著分化程度的降低、浸潤程度的加深和臨床分期的升高而降低。這些可能與腫瘤抑制蛋白p14ARF參與了癌基因誘導(dǎo)的p53失活，過表達(dá)的癌基因能使p14ARF蛋白表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。

在腫瘤轉(zhuǎn)化過程中，p14ARF和p53的失活與原癌基因的過表達(dá)有協(xié)同作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核Pokemon蛋白高表達(dá)的39例胃癌中同時(shí)有27例細(xì)胞核p14ARF蛋白低表達(dá)；在細(xì)胞核Pokemon蛋白低表達(dá)的11例胃癌中同時(shí)有9例細(xì)胞核p14ARF蛋白高表達(dá)，顯示胃癌組織中Pokemon蛋白表達(dá)與p14ARF蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。已有研究［12］發(fā)現(xiàn)，在ARF激動(dòng)劑中存在數(shù)個(gè)Pokemon結(jié)合位點(diǎn)及數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，可以調(diào)控ARF激動(dòng)劑，從轉(zhuǎn)錄水平抑制了ARF的產(chǎn)生，使細(xì)胞內(nèi)抑制機(jī)制缺陷，細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。設(shè)想如果有外源分子能夠拮抗或消除Pokemon的作用，則ARF可以發(fā)揮正常功能，從而消除癌變傾向。因此，能夠抑制Pokemon的藥物可能成為一種強(qiáng)有力的抗癌劑。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSIONS OF PROTEIN POKEMON AND p14ARFIN GASTRIC CARCINOMA TISSUES AND THEIR SIGNIFICANCE IN CLINICAL BIOLOGICAL BEHAVIOUR

JIA Nan1，LIU Yueping2，LIYong1*
（1.The Third Department of Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；
2.Department of Pathology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo explore the relationship of the clinical biological behaviour and the expressions of Pokemon protein and p14ARFprotein in gastric carcinoma tissues.MethodsThe expressions of Pokemon and p14ARFproteins in specimens resected from 50 gastric carcinoma tissues and 20 adjacent noncancerous gastric tissue were detected by immunohistochemicalmethod.The correlations between the expression of Pokemon and p14ARFand the clinical histopathologic characters were retrospectively analyzed，including patientsˊsex and age，tumor location and size，gross type，differentiation degree，infiltration depth，lymph nodemetastasis，and clinical stage，etc.ResultsThe expressions of both Pokemon protein and p14ARFwere located in cellular nucleus in gastric carcinoma and normal gastric mucosa which showed buffy granulation in positive staining cellular nucleus.The expression rates of Pokemon in gastric carcinoma and adjacent noncancerousgastric tissuewere 78%and 45%，respectively，in which the difference was statistically significant（P＜0.05）.The expression rates of p14ARFprotein ingastric carcinoma and adjacent noncancerous gastric tissue were 42%and 90%，respectively.The difference also was statistically significant（P＜0.05）.②Pokemon protein expression rates of gastric carcinoma tissue were 87.5%and 40%in the presence and absence of lymph nodemetastasis，which was significantly different（P＜0.05）；Pokemon protein expressions were increased with the increases in tumor size，depth of invasion，and clinical stage.③The expression rates of p14ARFprotein were 37.5% and 80%in gastric carcinoma tissues with and without lymph node metastasis，and the latter was significantly higher than the former（P＜0.05）.p14ARFprotein expressions were decreased with the decrease in the degree of tumor differentiation and increases in the depth of invasion and clinical stage.④There was a significant negative correlation between the positive nuclear Pokemon expression and the positive nuclear p14ARFexpression（P＜0.05）.ConclusionPokemon overexpression and p14ARFlow expression in gastric carcinoma tissues can indicate the extent of clinical biological behaviour，such as the carcinogenesis，development，invasion，and metastasis of gastric carcinoma.

stomach neoplasms；pokemon protein；tumor suppressor protein p14ARF

R735.2

A

1007-3205（2012）03-0263-05

2011-08-01；

2012-02-29

賈楠（1981-），男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事胃腸腫瘤診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.006