姜黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-109細胞增殖和凋亡的影響

龔 淼，李 莉，包憲霞，孟 麗，張亞楠，郭淺妤，趙 昱，張 雷*

（1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，河北石家莊 050017；2.石家莊市醫(yī)學高等?？茖W校組織學與

胚胎學教研室，河北石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院電鏡實驗中心，河北石家莊 050017）

·論 著·

姜黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-109細胞增殖和凋亡的影響

龔 淼1，李 莉1，包憲霞2，孟 麗3，張亞楠1，郭淺妤1，趙 昱1，張 雷1*

（1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，河北石家莊 050017；2.石家莊市醫(yī)學高等專科學校組織學與

胚胎學教研室，河北石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院電鏡實驗中心，河北石家莊 050017）

目的研究姜黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌（esophageal carcinoma 109，Ec-109）細胞增殖和凋亡的影響。方法采用噻唑蘭（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測不同濃度姜黃素對人食管癌Ec-109細胞增殖的影響；流式細胞術檢測Ec-109細胞的凋亡情況；免疫細胞化學方法檢測Fas、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白表達的情況。結果姜黃素可顯著抑制Ec-109細胞的增殖，呈劑量和時間依賴性，半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentraltion 50，IC50）為22.09μmol/L（姜黃素濃度為80μmol/L作用60h）。不同濃度姜黃素均可誘導Ec-109細胞凋亡。姜黃素可顯著下調(diào)Ec-109細胞PCNA蛋白表達，顯著上調(diào)Fas蛋白表達。結論姜黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-109細胞的增殖，誘導其凋亡。

姜黃素；食管腫瘤；細胞增殖；細胞凋亡

姜黃素是從姜科植物的根莖姜黃中提取的一種植物多酚，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等廣泛的藥理作用［1］。近年來有研究［2］發(fā)現(xiàn)姜黃素在抗消化系統(tǒng)腫瘤中有顯著作用，但其對低分化食管癌細胞的作用尚未見報道。本研究擬探討姜黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌（esophageal carcinoma 109，Ec-109）細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和藥物：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）；噻唑蘭（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）；熒光染料（Sigma公司，美國）；兔抗人Fas抗體、兔抗人增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體和SP試劑盒（北京中山金橋生物技術有限公司）。姜黃素（Sigma公司，美國），實驗前用1mL二甲基亞砜充分溶解，用RPMI1640培養(yǎng)液配成終濃度為80μmol/L的母液，后稀釋至所需濃度。

1.1.2 細胞株：人食管癌Ec-109細胞株由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所建系，本實驗室凍存。接種細胞于含15%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng)瓶放置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定姜黃素對Ec-109細胞增殖的影響：取對數(shù)生長期的Ec-109細胞和正常人外周血單個核細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔滴加200μL單細胞懸液，使每孔含量1.4×103個細胞，設8個復孔，同時接種6個96孔板，常規(guī)培養(yǎng)16h后，實驗組加入終濃度分別為20、40和80μmol/L姜黃素，陰性對照組加入等體積完全培養(yǎng)液，空白對照組只加培養(yǎng)液不加細胞作為比色時調(diào)零用。分別在常規(guī)培養(yǎng)20、40和60 h后取出2個培養(yǎng)板每孔滴加MTT溶液（5g/L）20μL，37℃培養(yǎng)箱中孵育4h后終止培養(yǎng)。去除孔內(nèi)上清液，每孔滴加DMSO 200μL，振蕩15min。用酶標儀在570nm處測定各孔吸光度（A值），記錄結果，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率計算公式，增殖抑制率（%）=（1-實驗組A/對照組A）×100%。

1.2.2 流式細胞術測定姜黃素對Ec-109細胞凋亡的影響：取12瓶對數(shù)生長期Ec-109細胞，不同濃度（0、20、40和80μmol/L）姜黃素分別作用20、40和60h。每隔20h取出不同藥物濃度細胞4瓶，收集細胞分別放入4個離心管內(nèi)標記后進行離心，制成細胞濃度為1×109個/L的單細胞懸液離心后棄上清液緩慢加入預冷70%無水乙醇7m L，4℃過夜。采用PI單染法，以10%雞紅細胞作內(nèi)參標準，與樣品同步染色，每份樣品中加入1mL PI染液，在4℃避光孵育30min。用488nm氬離子激光器激發(fā)由帶630nm帶通濾光片接收，通過散點圖收集10 000個細胞，分析PI熒光直方圖上凋亡細胞百分率。

1.2.3 免疫細胞化學方法測定Fas、PCNA蛋白的表達：取對數(shù)生長期細胞制成濃度為1×108個/L的單細胞懸液，接種到放有蓋玻片的6孔板，培養(yǎng)箱孵育24h，使細胞貼壁于蓋玻片上。24h后取出6孔板去上清液分別給予藥物終濃度為0、20、40、80 μmol/L的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)20、40和60h后分別取出蓋玻片。SP法進行免疫細胞化學染色，3%甲醇-H2O2室溫處理10min，微波抗原修復（9℃）15min。免疫細胞化學法染色。用己知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。采用圖像分析系統(tǒng)進行定量分析，每張玻片隨機取5個高倍視野，測定特異性著色的平均積分光密度值來分析相應指標的蛋白表達的水平，平均積分光密度值越高，其表達越高。

1.3 統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK檢驗（q檢驗）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 姜黃素對Ec-109細胞增殖的影響：MTT結果顯示，不同濃度姜黃素對Ec-109細胞有明顯生長抑制作用（P＜0.05），當80μmol/L姜黃素處理Ec-109細胞60h后，其增殖抑制率達到85.7%，顯示出較強的增殖抑制作用。姜黃素作用20h的半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentraltion 50，IC50）為113.28μmol/L（P＜0.05），作用40h的IC50為13.28 mg/L（P＜0.05），作用60h的IC50為8.13mg/L（P＜0.05）。細胞增殖抑制率隨姜黃素濃度的升高和作用時間的延長而逐漸升高，具有濃度的時間依賴性。見表1。

表1 姜黃素對Ec-109細胞增殖抑制率的影響Table 1 Effects of Curcum in on the proliferation of Ec-109 cells

2.2 姜黃素對Ec-109細胞凋亡的影響：流式細胞術結果顯示，不同濃度姜黃素溶液對Ec-109細胞有明顯的凋亡誘導作用，細胞凋亡率隨姜黃素濃度的升高和作用時間的延長而逐漸升高，具有濃度和時間依賴性（P＜0.05），見表2。

表2 姜黃素對Ec-109細胞凋亡率的影響Table 2 Effect of curcum in on the apoptosis of Ec-109 cells

圖1 PCNA在陰性對照組Ec-109細胞中的陽性表達（免疫細胞化學法×200）Figure 1 Positive expression of PCNA in Ec-109 cells of negative control group（immunocytochemistry×200）

圖2 PCNA在經(jīng)80μmol/L姜黃素作用40h后的Ec-109細胞中的弱陽性表達（免疫細胞化學法×200）Figure 2 Weak positive expression of PCNA in Ec-109 cells treated with 80μmol/L curcumin for 40h（immunocytochemistry×200）

2.3 姜黃素對Ec-109細胞Fas、PCNA蛋白表達的影響：Fas蛋白陽性表達部位為細胞膜，PCNA蛋白陽性表達部位為細胞核。免疫細胞化學結果顯示，PCNA蛋白在姜黃素作用組表達明顯下調(diào)，在陰性對照組呈強陽性表達，F(xiàn)as蛋白在姜黃素作用組表達明顯上調(diào)，在陰性對照組呈陰性表達，見表3、4，圖1～4。

表3 姜黃素對Ec-109細胞PCNA蛋白表達的影響Table 3 Effects of curcum in on the expression of PCNA protein in Ec-109 cells for 20h、40h、60h by ICC

表4 姜黃素對Ec-109細胞Fas蛋白表達的影響Table4 Effects of curcum in on the expression of Fas protein in Ec-109 cells for 20h、40h、60h by ICC

圖3 Fas在陰性對照組Ec-109細胞中的陰性表達（免疫細胞化學法×200）Figure 3 Negative expression of Fas in Ec-109 cells of negative control group（immunocytochemistry×200）

圖4 Fas在經(jīng)80μmol/L姜黃素作用40h后的Ec-109細胞中的陽性表達（免疫細胞化學法×200）Figure 4 Positive expression of Fas in Ec-109 cells treated with 80μmol/L curcumin for 40h（immunocytochemistry×200）

3 討 論

本實驗研究了姜黃素對人食管癌Ec-109細胞株的增殖抑制和凋亡誘導作用。腫瘤細胞區(qū)別于正常細胞的一個重要特征就是腫瘤細胞可以持續(xù)分裂并不斷增殖［3］。本實驗結果顯示姜黃素對Ec-109細胞增殖有顯著的抑制作用，并呈劑量與時間依賴性，隨著作用時間的延長，80μmol/L濃度姜黃素組對Ec-109細胞的生長抑制作用大于20μmol/L濃度組，姜黃素溶液在80μmol/L濃度下作用60h對細胞的抑制增殖作用最明顯，IC50為8.13mg/L。

細胞凋亡是指由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預存的死亡程序誘導的細胞死亡過程［4］。凋亡細胞的DNA分子發(fā)生斷裂，分子量小的DNA片段穿過細胞膜丟失，分子量大的片段形成一個DNA含量小于二倍體的區(qū)域，在流式細胞儀檢測中形成位于G0/G1峰之前的亞G1峰，由于壞死的細胞檢測不出現(xiàn)此峰，故此峰被稱作凋亡峰［5］，凋亡峰的高度和寬度與凋亡細胞的數(shù)量成正比，本研究結果顯示，姜黃素可以誘導Ec-109細胞凋亡，并有量效和時效依賴關系，此結果與前面MTT和流式細胞儀分別檢測細胞的增殖能力和細胞周期相一致。

綜上所述，姜黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-109細胞的增殖，誘導其凋亡。

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（本文編輯：劉斯靜）

EFFECTSOF CURCUM IN ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSISOF HUMAN ESOPHAGEAL CARCINOMA Ec-109 CELLS IN VITRO

GONG Miao1，LILi1，BAO Xianxia2，MENG Li3，ZHANG Yanan1，GUO Qianyu1，ZHAO Yu1，ZHANG Lei1*
（1.Department of Histology and Embryology，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Histology and Embryology，Shijiazhuang Medical College，
Shijiazhuang 050000，China；3.Laboratory Center of Electron Microscopy，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo observe the effects of curcumin on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma 109（Ec-109）cell line in vitro.MethodsThe inhibitory effect of curcumin on the proliferation of human Ec-109 cells at different concentrations was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.The changes of cellapoptosis rate of tumor cellswere determined by flow cytometry（FCM）.The expressions of Fas and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）proteins were examined by immunocytochemical technique.ResultsCurcumin significantly inhibited the proliferation of Ec-109 cells in a dose-and time-dependentmanner，with the inhibitory concentraltion 50（IC50）of22.09μmol/L（Curcumin concentration for 80μmol/L role of 60h）.Different concentrations of curcumin can induce apoptosis of Ec-109 cell.Curcumin dramatically inhibited protein expression of PCNA，while upregulated the expression of Fas protein.ConclusionCurcumin can inhibit theproliferation of Ec-109 cells and induce the apoptosis of Ec-109 cells in vitro.

curcumin；esophageal neoplasms；cell proliferation；apoptosis

R329.28

A

1007-3205（2012）02-0125-04

2011-12-05；

2012-01-27

河北省科技廳計劃指導課題（10276181）

龔淼（1983-），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院助教，醫(yī)學學士，從事組織學與胚胎學研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.001