兩個海洋環(huán)肽Galaxamide類似物的合成及抗腫瘤活性研究

陳 萌，曲 桐，徐石海

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)系，廣東 廣州 510632)

環(huán)肽類化合物是海洋生物次生代謝的產(chǎn)物，不僅具有多樣及獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎和免疫抑制等多種生物活性。Galaxamide是從中國南海西沙群島的海藻中分離得到的一個新型環(huán)五肽環(huán)(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰)，體外抗腫瘤實驗表明該化合物對人體腎癌細胞(GRC-1)、人肝癌細胞(HepG2)有較好的細胞毒性(IC50分別為4.26 μg·mL-1、4.63 μg·mL-1)[1]。由于環(huán)肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及其特殊的構(gòu)象約束作用[2],與線性肽相比,穩(wěn)定性更好,抗酶解能力更強。正是由于環(huán)肽獨特的空間三維結(jié)構(gòu),其對于研究藥物作用機理及開發(fā)新藥都有著重要作用[3]。為了進一步探討構(gòu)效關(guān)系(SAR),作者在前人研究的基礎(chǔ)上[4]采用經(jīng)典的“3+2”全合成方法，同時改變原料亮氨酸構(gòu)型和環(huán)肽的N-甲基的數(shù)量,設(shè)計合成了兩個Galaxamide類似物(圖1)，對其結(jié)構(gòu)進行了表征，并研究了其體外抗腫瘤活性。Galaxamide類似物的合成路線見圖2。

圖1 Galaxamide類似物的結(jié)構(gòu)式

圖2 Galaxamide類似物的合成路線

1 實驗

1.1 試劑與儀器

試劑均為市售AR或CP，未進一步純化。

1200型高效液相色譜儀，Agilent公司;4000 Q TRAP型質(zhì)譜儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；INOVA 500 MHz型核磁共振儀，美國Varian公司；R-210BUCHI型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；柱層析硅膠(200～300 目)，青島海洋化工廠。

產(chǎn)物純度由HPLC 檢測分析。色譜條件：C18柱(4.6 mm×100 mm，220 nm)，流動相70％～100％ CH3OH/0.1％ TFA，流速1 mL·min-1，梯度洗脫。

1.2 合成

1.2.1 Boc-Leu(a1)的合成

向250 mL的圓底燒瓶中連續(xù)加入THF(56 mL)、H2O(42 mL)和NaOH(1 mol·L-1，42 mL)溶液，冰浴冷卻下一次性加入L-Leu(2.62 g，20 mmol)，攪拌10 min使L-Leu溶解，然后一次性加入Boc2O(5.24 g，24 mmol)，冰浴下繼續(xù)攪拌10 min，然后緩慢升至室溫并調(diào)pH值為10～11，攪拌過夜。減壓蒸除溶劑后用無水乙醚(80 mL×2)萃取，水相在冰浴下冷卻，用鹽酸酸化至 pH值為2～3，然后用乙酸乙酯(80 mL×3)萃取，合并有機相并用飽和食鹽水(80 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾后蒸除溶劑，得到無色晶體 2.44 g，收率93％。MS(ESI)，m/z：232.2[M+H]+，249.2[M+NH4]+，254.3[M+Na]+。

1.2.2 Boc-Leu-N-Me-D-Leu-OBn(a2)的合成

1.2.3N-Me-Leu-OBn(a3)的合成

氮氣保護、冰浴冷卻下，向250 mL的圓底燒瓶中一次性加入a1(2.31 g，10 mmol)和THF(30 mL)，緩慢滴加碘甲烷(3.15 mL,15 mmol)，反應(yīng)30 min后，緩慢加入60％氫化鈉(50 mmol，1.2 g)。冰水浴下反應(yīng)1 h后，室溫下反應(yīng)過夜。冰水浴下，滴加飽和氯化銨水溶液(10 mL)，再加飽和碳酸氫鈉水溶液(20 mL)，減壓蒸去THF。水溶液用石油醚洗滌(25 mL×2)后，冰水浴冷卻下，滴加1 mol·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)水溶液pH值至 2～3，用乙酸乙酯提取(50 mL×4)。合并有機相，依次用5％的硫代硫酸鈉(75 mL)、飽和食鹽水(75 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾，濃縮，油泵干燥，得黃色油狀物1.99 g，收率為87％。MS(ESI)，m/z：246.2[M+H]+，263.2[M+NH4]+，268.3[M+Na]+。

1.2.4 Boc-Leu-N-Me-Leu-OBn(a4)的合成

1.2.5 Boc-Leu-N-Me-Leu-Leu-OBn(a5)的合成

取a4(8 mmol，3.59 g)溶于30 mL CH2Cl2中，氮氣保護下加入苯甲醚(16 mmol，1.7 mL)，冰浴下攪拌，緩慢滴加TFA(8 mL)，反應(yīng)4 h后，減壓蒸除溶劑，再加入CH2Cl2，減壓蒸除，重復(fù)操作除去TFA，干燥，得到油狀物直接用于下一步實驗。

1.2.6 五肽Boc-Leu-N-Me-Leu-Leu-Leu-N-Me-D-Leu-OBn(a6)的合成

取a2(1.94 mmol，1.0 g)溶于20 mL CH2Cl2中，氮氣保護下加入苯甲醚(3.98 mmol，0.4 mL)，冰浴下攪拌，緩慢滴加TFA(5 mL)，反應(yīng)4 h后，減壓蒸除溶劑，再加入CH2Cl2，減壓蒸除，重復(fù)操作除去TFA，干燥，得到油狀物直接用于下一步實驗。

向50 mL二口圓底燒瓶中加入a5(2.3 mmol，1.0 g)的甲醇溶液(20 mL)，氮氣保護下加入0.2 g 10％ Pd/C，封口，攪拌下通入氫氣，室溫下反應(yīng)，TLC跟蹤，3 h后，原料點消失，停止通入氫氣，過濾，回收Pd/C，減壓蒸除溶劑，干燥，得到無色固體直接用于下一步實驗。

將上步無色固體溶于5 mL THF中，置于冰水浴中攪拌，氮氣保護下連續(xù)加入DEPBT(2.9 mmol，0.87 g)、DIEA(2.9 mmol，0.5 mL)反應(yīng)5 min后，滴加溶于CH2Cl2(5 mL)的上述油狀物，自然升至室溫，TLC跟蹤反應(yīng)。24 h后反應(yīng)完成，減壓蒸除溶劑。直接進行硅膠柱層析(淋洗劑V正己烷∶V丙酮=20∶1),得無色固體1.27 g，三步收率82％。MS(ESI),m/z：803.1[M+H]+，820.1[M+NH4]+，825.1[M+Na]+。

1.2.7 環(huán)五肽c(Leu-N-Me-Leu-Leu-Leu-N-Me-D-Leu)(a7)的合成

取保護五肽(a6)(0.15 mmol，0.12 g)溶于20 mL甲醇中，通入氮氣保護后加入0.2 g 10％ Pd/C，通入氫氣，室溫下反應(yīng)3 h。過濾回收Pd/C，濾液蒸干，干燥得產(chǎn)物，加入20 mL CH2Cl2溶解，冰浴攪拌下，加入5 mL TFA，冰浴下反應(yīng)3 h，減壓濃縮，再加CH2Cl2，減壓濃縮，重復(fù)3次，再用油泵抽干得到產(chǎn)物，溶于25 mL THF-CH3CN-CH2Cl2(2∶2∶1)，室溫下連續(xù)加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，0.134 g)、DEPBT(0.130 g)和N，N，N′，N′-四甲基異脲四氟化硼(TBTU，0.14 g)，每12 h LC-MS檢測，連續(xù)反應(yīng)3 d后，反應(yīng)完全，減壓抽干，用CH2Cl2溶解后，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，用反相HPLC分離得到環(huán)五肽白色固體(a7)37.9 mg，收率42.5％。

1.2.8 環(huán)五肽c(Leu-N-Me-Leu-Leu-N-Me-Leu-N-Me-Leu)(b1)的合成

取保護五肽Boc-Leu-N-Me-Leu-Leu-N-Me-Leu-N-Me-Leu-OBn(0.15 mmol)，按照1.2.7方法，合成分離后得到環(huán)五肽白色固體(b1)35 mg,收率38.0％。

1.3 體外抗腫瘤活性篩選

采用MTT法對所合成的目標(biāo)化合物進行體外細胞毒活性篩選，所選細胞株為人肝癌細胞(HepG2)、人肺癌細胞(A549)、人宮頸癌細胞(Hela)，將其抑制活性與Galaxamide進行對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物表征

2.2 環(huán)合試劑的選擇

在環(huán)肽合成過程中，環(huán)合試劑的選擇對目標(biāo)化合物的合成至關(guān)重要，決定著關(guān)環(huán)是否成功及收率的高低，既是合成的重點也是難點。本研究選擇DEPBT、HATU、TBTU作為環(huán)合試劑，溶劑體系為THF-CH3CN-CH2Cl2(2∶2∶1),對環(huán)五肽的關(guān)環(huán)效果理想。同時對文獻[4]所報道的環(huán)合步驟進行改進，減少一半溶劑體積、增加一倍環(huán)合試劑用量，不僅能夠提高環(huán)合的收率，同時在該反應(yīng)的副產(chǎn)物中，含有25％～28％的五肽二聚體(環(huán)十肽)，已對該部分進行了進一步的譜圖分析，以確定其結(jié)構(gòu)。

2.3 分離技術(shù)及條件的選擇

天然產(chǎn)物的全合成不僅要求合成方法得當(dāng)、合成步驟合理，而且對分離技術(shù)及條件的選擇要求也很高。尤其是環(huán)肽的分離，絕大部分都是用HPLC反相制備柱分離，耗費大量的時間和金錢。因此，作者對合成的中間體及目標(biāo)化合物的分離采用了不同的方法和條件：(1)對線性肽中間體分別采用石油醚與丙酮、正己烷與丙酮體系為淋洗劑，硅膠柱層析分離。(2)對目標(biāo)產(chǎn)物環(huán)肽的分離采取甲醇與水體系為淋洗劑，C18反相硅膠柱分離。經(jīng)HPLC分析，產(chǎn)物純度在98％以上。

2.4 體外抗腫瘤活性分析(表1)

表1 體外抗腫瘤活性比較

由表1可知：(1)含有D構(gòu)型的環(huán)肽a7能增強抗腫瘤活性，可以對其進行進一步的藥理研究。(2)環(huán)肽b1相比Galaxamide多了一個氮上甲基，其IC50較高，表明甲基數(shù)量的增多并不能增強環(huán)肽活性。

3 結(jié)論

以亮氨酸為起始原料，改變環(huán)合位點，全合成了兩個海洋環(huán)肽Galaxamide[環(huán)(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰)]類似物。通過1HNMR、13CNMR、MS對其結(jié)構(gòu)進行了表征，并對人肝癌細胞(HepG2)、人肺癌細胞(A549)、人宮頸癌細胞(Hela)進行了體外抗腫瘤活性的研究。結(jié)果表明，含有D構(gòu)型的環(huán)肽能增強抗腫瘤活性，而環(huán)肽氮上甲基數(shù)量的增多并不能增強環(huán)肽抗腫瘤活性。

參考文獻：

[1]Xu W J，Liao X J，Xu S H，et al.Isolation，structure determination，and synthesis of Galaxamide，a rare cytotoxic cyclic pentapeptide from a marine algaeGalaxaurafilamentosa[J].Org Lett，2008,10(20):4569-4572.

[2]Fairlie David P，Abbenante Giovanni，March Darren R.Macrocyclic peptide-mimetics forcing peptides into bioactive conformations[J].Current Medicinal Chemistry，1995,2(2):654-686.

[3]Aungst Bruce J，Saitoh Hiroshi.Intestinal absorption barriers and transport mechanisms，including secretory transport，for a cyclic peptide，fibrinogen antagonist[J].Pharmaceutical Research,1996，13(1):114-119.

[4]郭偉,鄧攀,楊會付,等.環(huán)(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰)的合成[J].精細化工，2010,27(9):855-858.