胃癌SGC7901細(xì)胞特異性結(jié)合肽的篩選及鑒定

郭彩霞 梁曉秋 何曉娟

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。胃癌的早期發(fā)現(xiàn)早期治療尤為重要。1985年美國(guó)Missouri大學(xué)Smith等［1］創(chuàng)立了噬菌體展示技術(shù)。本文應(yīng)用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，篩選與人胃癌組織特異性結(jié)合的短肽，以指導(dǎo)臨床胃癌的早期診斷和靶向治療，提高藥物靶向的特異性，實(shí)現(xiàn)治療的針對(duì)性和安全性［2］。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株:人胃癌細(xì)胞株SGC-7901為本室保存。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/C裸小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。噬菌體肽庫(kù):噬菌體環(huán)7肽文庫(kù)試劑盒 (Ph.D.-C7CTm Phage Display Peptide Library Kit);HRP標(biāo)記的抗噬菌體單克隆抗體鼠抗M13噬菌體抗體為美國(guó)Pharmacia公司產(chǎn)品。M13噬菌體單鏈DNA快速提取試劑盒為美國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品。

1.2 裸鼠體內(nèi)噬菌體的篩選

尾靜脈注射噬菌體隨機(jī)環(huán)7肽文庫(kù)2×1011pfu/只(將其溶于RPMI-1640溶液中)，15 min后10%水合氯醛麻醉(0.03 ml/10 g)，通過(guò)心臟灌注溫?zé)岬纳睇}水20 ml至肝臟完全變白，組織稱重后剪碎，加3 ml 0.1%PBST 洗滌組織3 次，3 000 r/min離心10 min，棄去上清。取1 ml大腸桿菌ER2738與組織靜止感染30 min后，加入4 ml LB培養(yǎng)液室溫孵育30 min，取100μl感染后的菌液測(cè)滴度，并計(jì)算總產(chǎn)出量。將剩余腫瘤組織感染后的菌液3 000 r/min離心10 min，沉淀全部擴(kuò)增到10 ml LB，220 r/min，37℃振搖4.5 h，擴(kuò)增與胃癌組織相結(jié)合的噬菌體，4℃下離心純化，用于下一輪篩選，共4輪。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定噬菌體單克隆對(duì)SGC7901的親和力

按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒說(shuō)明測(cè)定噬菌體單克隆對(duì)SGC7901的親和力。

1.4 DNA序列的測(cè)定

將ELISA鑒定的噬菌體陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，試劑盒提取陽(yáng)性克隆的單鏈DNA，測(cè)序，并根據(jù)所測(cè)得的堿基序列比對(duì)出氨基酸序列。

1.5 結(jié)果判定

免疫組化染色按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，結(jié)果判定:陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體肽庫(kù)的胃癌裸鼠體內(nèi)篩選

15只裸鼠致瘤1～2周后，12只長(zhǎng)出瘤狀腫塊，成瘤率80%。噬菌體環(huán)七肽文庫(kù)尾靜脈注射胃癌腫瘤裸鼠，每一輪篩選前均加入相同滴度的噬菌體(2×1011pfu/ml)，篩選后分別測(cè)滴度(pfu/m l)。4輪篩選后，從單位腫瘤組織中回收的噬菌體量為單位肝臟組織的88.8倍、單位腦組織的6.7×104倍、單位心臟組織9.7×104倍，可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)4輪篩選，噬菌體在胃癌腫瘤組織中得以富集(表1)。

表1 噬菌體肽庫(kù)胃癌裸鼠體內(nèi)篩選結(jié)果(pfu/g)

2.2 免疫組化測(cè)定噬菌體的富集

經(jīng)過(guò)4輪篩選，腫瘤組織結(jié)合的噬菌體得到了很好地富集，且區(qū)域廣泛，見(jiàn)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜呈明顯棕黃色染色，肝組織中極少數(shù)細(xì)胞呈淺黃色染色，心臟和腦組織中無(wú)黃色染色。

2.3 ELISA鑒定重組噬菌體對(duì)SGC7901的親和力

噬菌體肽庫(kù)經(jīng)過(guò)4輪體內(nèi)篩選后，隨機(jī)挑選13個(gè)噬菌體克隆，以噬菌體原庫(kù)藍(lán)斑作為對(duì)照，得出各克隆的OD值，計(jì)算各噬菌體克隆對(duì)SGC7901的親和力。當(dāng)P/N(OD克隆/OD隨機(jī)對(duì)照克隆)＞2.1時(shí)，說(shuō)明此克隆對(duì)SGC7901的親和力強(qiáng)。ELISA結(jié)果顯示，P/N＞2.1的陽(yáng)性克隆有12個(gè)，P/N＞2.5的陽(yáng)性克隆有11個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 ELISA檢測(cè)第4輪篩選噬菌體克隆與SGC7901的親和力

2.4 測(cè)序結(jié)果

12個(gè)噬菌體陽(yáng)性單克隆測(cè)序均相同，堿基比對(duì)(表2)獲得外源性短肽一條，此短肽序列為PPRWMPS，其理論分子量為869.9 Daltons。7個(gè)氨基酸中，堿性氨基酸(R)占17.81%;非極性﹑疏水性氨基酸(W，P)占56.19%;極性﹑中性氨基酸(S，M)占25.99%，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 噬菌體克隆的測(cè)序波形圖

表2 序列結(jié)果讀取表

3 討論

胃癌作為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤發(fā)病率逐漸增高，占全世界死亡率的第二位［3］，其在我國(guó)惡性腫瘤中的發(fā)病率和病死率均居首位［4］。目前，胃癌的治療方法主要有手術(shù)治療﹑放療和化療。近年來(lái)胃癌的分子靶向治療是1種腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的某些標(biāo)志性分子作為治療的靶點(diǎn)，選擇性應(yīng)用阻斷劑，干預(yù)該靶點(diǎn)的分子調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)展的效果［5］。

Newton等應(yīng)用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，篩選得到特異性結(jié)合前列腺癌噬菌體肽段，并且將篩選的噬菌體熒光標(biāo)記與小鼠模型體內(nèi)成像成功［6］。有報(bào)道，用津白Ⅱ荷瘤小鼠，體內(nèi)篩選到乳腺癌特異性結(jié)合噬菌體融合肽［7］。陳貽玲等［8］從T7噬菌體文庫(kù)中篩選到肺癌早期檢測(cè)分子標(biāo)志群。Yang等［9］應(yīng)用改良的噬菌體展示技術(shù)(FliTrx細(xì)菌肽展示系統(tǒng))，篩選得到特異性結(jié)合高轉(zhuǎn)移性前列腺癌PC-3M-1E8細(xì)胞的肽段TMTP1(NVVRQ)，且將TMTP1與FITC結(jié)合物注射小鼠體內(nèi)能有效地檢測(cè)到轉(zhuǎn)移灶。腫瘤特異性結(jié)合肽iRGD(CRGDK/RGPD/EC)與抗癌化學(xué)藥物結(jié)合，使藥物有效地作用腫瘤組織，增強(qiáng)抗癌藥物的療效［10］。

實(shí)驗(yàn)中為了去除噬菌體文庫(kù)非特異性結(jié)合，我們采用心臟灌注并反復(fù)洗滌的方法，最大限度地避免了非特異性結(jié)合，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確。噬菌體滴度的測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)四輪體內(nèi)篩選，于對(duì)照組織相比，腫瘤組織回收的噬菌體量顯著增加，說(shuō)明此噬菌體與胃癌腫瘤組織特異性結(jié)合。噬菌體回收量以及組織免疫組化結(jié)果顯示，噬菌體在胃癌組織得到了很好的富集，送測(cè)的13個(gè)噬菌體單克隆中，測(cè)序結(jié)果表明有12個(gè)序列完全一致，即PPRWMPS出現(xiàn)的次數(shù)最多，提示此短肽可能對(duì)胃癌裸鼠模型的腫瘤組織具有很強(qiáng)的結(jié)合力，有望成為胃癌治療的靶點(diǎn)，為我們下一步研究此短肽與藥物的偶聯(lián)以獲得新的胃癌靶向化療藥物做好準(zhǔn)備。

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