HRM方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者胸水標(biāo)本癌細(xì)胞基因突變的臨床意義

李 梅，呂偉朋，韋 鴻，姜振富，呂海辰，呂 申

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，遼寧大連116027;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧大連116027; 3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)(8年制)2007級(jí)，上海200032)

HRM方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者胸水標(biāo)本癌細(xì)胞基因突變的臨床意義

李 梅1，呂偉朋1，韋 鴻1，姜振富2，呂海辰3，呂 申1

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，遼寧大連116027;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧大連116027; 3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)(8年制)2007級(jí)，上海200032)

［目的］探討應(yīng)用HRM方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者胸水標(biāo)本癌細(xì)胞EGFR、KRAS基因突變用于指導(dǎo)EGFR酪氨酸激酶受體抑制劑治療的可行性。［方法］收集36例非小細(xì)胞肺癌患者胸水標(biāo)本，常規(guī)提取DNA，HRM方法檢測(cè)KRAS基因第2外顯子、EGFR基因第19和21外顯子突變。統(tǒng)計(jì)分析胸水標(biāo)本與前期檢測(cè)過(guò)的非小細(xì)胞肺癌組織KRAS、EGFR突變率差異。［結(jié)果］胸水標(biāo)本36例中，2例(5.6%)KRAS突變，10例(27.8%)EGFR突變(其中EGFR第19和21外顯子突變各5例)。前期檢測(cè)過(guò)的非小細(xì)胞肺癌組織KRAS和EGFR突變率分別為5.8%和36.3%。KRAS和EGFR突變率在胸水標(biāo)本與前期非小細(xì)胞肺癌組織中差異均無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。［結(jié)論］對(duì)難以獲得肺癌組織標(biāo)本的非小細(xì)胞肺癌患者可應(yīng)用HRM方法檢測(cè)胸水標(biāo)本篩查KRAS、EGFR基因突變，指導(dǎo)EGFR酪氨酸激酶受體抑制劑應(yīng)用。

HRM;胸水標(biāo)本;非小細(xì)胞肺癌

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，手術(shù)治療和化療是對(duì)其治療的主要手段。然而一些晚期NSCLC患者，因失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，只能通過(guò)化療控制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)生命。近年來(lái)分子靶向藥表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFRTKI)，如Gefitinib等在臨床逐漸推廣使用。該類藥物以其療效好、毒副作用小的特點(diǎn)給NSCLC患者帶來(lái)了希望。該藥物的針對(duì)性很強(qiáng)，患者間療效差異很大，且藥價(jià)昂貴。因此，在用藥前有效判斷NSCLC患者對(duì)該藥的敏感性非常必要。目前認(rèn)為EGFR第19或21外顯子突變是NSCLC對(duì)EGFRTKI藥物敏感的標(biāo)志，而KRAS第2外顯子突變則是耐藥的標(biāo)志。所以NSCLC患者在接受EGFRTKI類藥物治療前，通常需要檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的這3段基因突變情況，以確定是否用藥。對(duì)于手術(shù)NSCLC患者，通?？梢岳檬中g(shù)切除的癌組織標(biāo)本檢測(cè)這3段基因的突變情況，但一些失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者常因?yàn)闊o(wú)法獲取腫瘤組織而失去對(duì)藥物敏感性檢測(cè)的機(jī)會(huì)。如果能夠從較容易獲得的胸水標(biāo)本中檢測(cè)上述3段基因突變情況，以此獲得患者對(duì)藥物敏感狀況的信息將具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2009年—2010年大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院經(jīng)細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)檢查確診為非小細(xì)胞肺癌的患者胸水36份。NSCLC患者中，男19例，女17例，年齡(63.8±13.9)歲。

1.2 DNA提取和HRM法基因突變檢測(cè)

常規(guī)DNA提取試劑盒法(天根生物技術(shù)有限公司北京)提取胸水標(biāo)本DNA，常規(guī)PCR擴(kuò)增EGFR第19、21外顯子和KRAS第2外顯子，引物，反應(yīng)條件、反應(yīng)體系同前［1-2］。應(yīng)用 High resolution melting(HRM)方法進(jìn)行基因突變檢測(cè)，應(yīng)用Lightscanner(Idaho Technology USA)在溫度72～90℃收集熒光信號(hào)［1-2］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較胸水標(biāo)本與前期新鮮肺癌組織標(biāo)本KRAS第2外顯子及EGFR第19、21外顯子突變率差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KRAS突變檢測(cè)

HRM法檢測(cè)KRAS基因突變結(jié)果顯示(圖1):胸水標(biāo)本36例中KRAS第2外顯子突變共2例(5.6%)，均為腺癌，患者男性1例、女性1例。

前期應(yīng)用HRM方法檢測(cè)103例NSCLC患者手術(shù)切除肺癌組織KRAS突變，發(fā)現(xiàn)突變的共6例(5.8%)［1］。應(yīng)用HRM方法檢測(cè)肺癌組織標(biāo)本和胸水標(biāo)本中KRAS突變，兩種標(biāo)本中KRAS突變率差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。

圖1 HRM法檢測(cè)KRAS第2外顯子突變結(jié)果Fig 1 Detecting KRAS mutation in exon 2 with HRM

2.2 EGFR突變檢測(cè)

HRM法檢測(cè)EGFR基因突變結(jié)果顯示(圖2、3):胸水標(biāo)本36例中EGFR第19、21外顯子突變共10例(27.8%)，其中19外顯子突變5例，均為腺癌，患者女性2例、男性3例;21外顯子突變5例，均為腺癌，患者女性3例、男性2例。

前期應(yīng)用HRM方法檢測(cè)157例NSCLC患者手術(shù)切除肺癌組織EGFR突變，發(fā)現(xiàn)19、21外顯子突變共57例(36.3%)［2］。應(yīng)用HRM方法檢測(cè)肺癌組織標(biāo)本和胸水標(biāo)本中EGFR突變，兩種標(biāo)本中EGFR突變率差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。

圖2 HRM法檢測(cè)EGFR第19外顯子突變結(jié)果Fig 2 Detecting EGFR mutation in exon 19 with HRM

圖3 HRM法檢測(cè)EGFR第21外顯子突變結(jié)果Fig 3 Detecting EGFR mutation in exon 21 with HRM

3 討論

分子靶向藥物 EGFR-TKI的出現(xiàn)及其在NSCLC治療中的應(yīng)用為NSCLC患者治療帶來(lái)希望。該藥針對(duì)性強(qiáng)、療效好、毒副作用小，但價(jià)格昂貴，如果不敏感患者盲目用藥，不但貽誤治療時(shí)機(jī)，同時(shí)也帶來(lái)家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，用藥前的敏感性檢測(cè)是有的放矢用藥得以實(shí)施的關(guān)鍵。2004年New England Journal Medicine和Science先后報(bào)道了有EGFR第19和21外顯子突變腫瘤的患者常對(duì)Gefitinib等EGFR-TKI藥物敏感，相反有KRAS第2外顯子突變腫瘤的患者多表現(xiàn)為對(duì)該類藥物的耐藥，隨后大量研究也證實(shí)EGFR和KRAS突變可以作為反映EGFR-TKI藥物敏感性的分子標(biāo)志［3-7］。對(duì)于手術(shù)治療的NSCLC患者可以應(yīng)用手術(shù)切除的癌組織(無(wú)論新鮮癌組織還是石蠟包埋的癌組織)進(jìn)行基因檢測(cè)，對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期NSCLC患者可以通過(guò)穿刺獲得癌組織標(biāo)本用于基因檢測(cè)，但穿刺風(fēng)險(xiǎn)大，臨床實(shí)施困難。胸水常出現(xiàn)在晚期NSCLC患者，但胸水中癌細(xì)胞數(shù)量不定，有時(shí)癌細(xì)胞數(shù)量極少，甚至找不到癌細(xì)胞，如果基因檢測(cè)方法靈敏度不高就會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。因此，靈敏的基因檢測(cè)方法是能否利用胸水檢測(cè)EGFR和KRAS基因突變，并判斷患者對(duì)EGFR-TKI藥物敏感性的關(guān)鍵。HRM方法是近年來(lái)出現(xiàn)的準(zhǔn)確、敏感、快速基因突變檢測(cè)方法，而且檢測(cè)過(guò)程均為閉管操作，能有效地避免污染機(jī)會(huì)，是可用于臨床的、便捷基因突變檢測(cè)方法。本研究組在國(guó)內(nèi)率先從美國(guó)引進(jìn)了該技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)從突變細(xì)胞比例低至2.5%的混合樣品中檢測(cè)出了變異基因［1］。通過(guò)比較胸水標(biāo)本與肺癌組織標(biāo)本的該方法EGFR、KRAS基因突變檢出率，作者發(fā)現(xiàn)兩種樣本的EGFR、KRAS基因突變檢出率幾乎相同，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。這提示HRM方法可用于檢測(cè)胸水標(biāo)本的EGFR、KRAS基因突變。本研究結(jié)果EGFR突變患者中男性患者比例較大，而KRAS突變患者中女性患者比例較大，這與作者的前期研究結(jié)果以及其他研究機(jī)構(gòu)的研究結(jié)果不一致，可能是由于樣本例數(shù)少所致，今后還將增加病例數(shù)進(jìn)一步研究。

總之，檢測(cè)胸水EGFR和KRAS基因突變HRM方法的建立對(duì)指導(dǎo)晚期NSCLC患者EGFR-TKI藥物的應(yīng)用有重要意義。

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Feasibility of HRM to detect gene mutations in hydrothorax of patients with non-small cell lung cancer

LI Mei1，Lü Wei-peng1，WEI Hong1，JIANG Zhen-fu2，Lü Hai-chen3，Lü Shen1
(1.Laboratory Center，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China;2.Neurosurgery Department，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China;3.2007 8-year-MD Candidate，Shanghai Medical University Fudan University，Shanghai 200032，China)

［Objective］To explore the clinical significance of HRM to detect EGFR and KRAS gene mutations in hydrothorax of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)for directing EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy.［Methods］The mutations of KRAS gene in exon 2 and EGFR gene in exon 19，21 were detected with HRM.The frequencies of EGFR and KRAS mutations between hydrothorax samples and cancer tissue samples from patients with NSCLC were analyzed statistically.［Results］There were 2 cases(5.6%)with KRAS mutations and 10 cases(27.8%)with EGFR mutations，including 4 cases in exon 19 and 5 cases in exon 21 found in hydrothorax with HRM.The frequencies of KRAS and EGFR mutation，detected in NSCLC tissues before，were 5.8%and 36.3%separately.There was no significant differencein either KRAS or EGFR between hydrothorax and cancer tissue samples.［Conclusion］It is helpful to patients with NSCLC who have lost the operation opportunity to detect the gene mutation in hydrothorax with HRM in directing the EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy.

HRM;hydrothorax samples;non-small cell lung cancer

R730

A

1671-7295(2012)04-0321-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81071805)

2012-04-05;2012-06-20

李梅(1977-)，女，遼寧撫順人，主治醫(yī)師。

呂申，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail:lvshen1956@yahoo.com.cn