肺纖維化抗補(bǔ)體活性道地藥材篩選研究

劉 哲，雷鈞濤

（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林省 吉林市 132013）

近年來(lái)肺纖維化發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢(shì)，研究表明肺纖維化與機(jī)體免疫能力下降以及肺間質(zhì)組織受到損害有直接關(guān)系[1]。另外，有報(bào)道稱(chēng)重癥非典型性肺炎，即SARS也和補(bǔ)體系統(tǒng)的激活程度有關(guān)[2－3]。

補(bǔ)體系統(tǒng)作為人體重要的免疫防御系統(tǒng)之一，可以抵御外來(lái)微生物侵害，并且在維持機(jī)體平衡等生理過(guò)程方面起著重要作用[4]。目前臨床廣泛應(yīng)用的抗補(bǔ)體活性藥物大多為非天然產(chǎn)物類(lèi)補(bǔ)體抑制劑，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生各種副作用，且治療費(fèi)用昂貴以及在適應(yīng)證選擇等方面存在諸多問(wèn)題。徐晗、章蘊(yùn)毅等[5]報(bào)道稱(chēng)，近年來(lái)在天然產(chǎn)物中分離出的多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的抗補(bǔ)體活性成分中，以多聚糖化合物和糖基化蛋白為多，通過(guò)體外抗溶血實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝Y選出生物活性較好的一些化合物。植物藥中廣泛存在具有抗補(bǔ)體作用的活性成分，多糖作為主要活性成分之一具有顯著的抗補(bǔ)體活性。研究表明，在許多中草藥中含有多糖成分，其中大多數(shù)為酸性雜多糖，而組成其酸性部分多為葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸[6]，它們對(duì)補(bǔ)體活性起到一定的調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制是在補(bǔ)體蛋白上存在識(shí)別點(diǎn)，可以識(shí)別多糖的結(jié)構(gòu)，從而激活補(bǔ)體系統(tǒng)[7]。因此，以植物藥中多糖用作新型補(bǔ)體抑制劑的研究與開(kāi)發(fā)，日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

東北作為我國(guó)中藥的重要產(chǎn)區(qū)之一，中草藥資源豐富。許多中草藥在經(jīng)多年臨床應(yīng)用后，證明具有較好的抗過(guò)敏、消炎和免疫調(diào)節(jié)作用，這就為從中尋找有效抗補(bǔ)體活性成分提供了可能。本文選取桔梗、桑皮、杏仁等多種東北道地藥材，通過(guò)采用體外溶血試驗(yàn)考察其總抗補(bǔ)體活性，為天然藥物抗補(bǔ)體活性的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 道地藥材

本文選取蒼術(shù)、桔梗、桑皮、杏仁、前胡、獨(dú)活等16種東北道地藥材，經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院雷鈞濤教授鑒定均為正品。藥材粉碎過(guò)40目篩，備用。

1.2 試劑

α-萘酚、CaCl2、EGTA、MgCl2、NaCl、NaOH、95%乙醇、乙醚、苯酚、巴比妥鈉、巴比妥、丙酮、硫酸、三氯醋酸、枸櫞酸鈉等均為分析純。

1.3 儀器

R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（步琪，瑞士）；TD-5A型低溫高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；Well scan MK3型酶標(biāo)儀（Thermo Labsyst，芬蘭）；TH2-0型恒溫振蕩器（北京浪華時(shí)代科技發(fā)展有限公司）；Freezedryerl8型冷凍干燥器（Labconco公司，美國(guó)）。

1.4 動(dòng)物

豚鼠（200～250g），雌雄不限，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取

實(shí)驗(yàn)采用乙醇滲漉提取。取每種藥材10g，煮沸3次，煮沸后將母液合并、濃縮，用三氯醋酸在4℃下脫蛋白；離心后，取上清液用NaOH中和，流水透析48h；濃縮，經(jīng)乙醇沉淀；沉淀冷凍干燥得粗多糖[8]。

2.2 補(bǔ)體經(jīng)典途徑的溶血活性（CH50）測(cè)定[9]

2.2.1 溶液配制

配制5倍濃縮巴比妥緩沖液（5×BBS），使用時(shí)稀釋成巴比妥緩沖液（BBS）。2%羊紅細(xì)胞（SRBC）：取綿羊血2mL，用BBS洗滌，后以800r·min－1離心3min，重復(fù)3次，再以3000r·min－1離心10min，然后用BBS配制成2%SRBC。1000溶血素：用BBS配制成1∶1000溶血素溶液。

供試溶液：分別稱(chēng)取上述各供試藥材粗多糖4mg。用BBS超聲溶解成1∶1溶液，濃度為5mg·mL－1；分別加BBS稀釋?zhuān)瞥?∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128共8個(gè)濃度的供試品溶液。

2.2.2 補(bǔ)體制備及效價(jià)測(cè)定

取豚鼠股動(dòng)脈血10mL，4℃放置，凝固1h，以800r·min－1離心5min，取血清，加2mL 2%SRBC，混勻后，以800r·min－1離心5min，取上清作為補(bǔ)體分裝，置-70℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

補(bǔ)體經(jīng)典溶血系統(tǒng)的建立：取補(bǔ)體0.1mL，加入BBS配制成1∶10溶液，再用BBS分別以1／2倍稀釋?zhuān)渲瞥?∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1280溶液。分別取1∶1000溶血素、各濃度補(bǔ)體、2%SRBC各0.1mL，溶于0.3mL BBS中混勻，于37℃水浴中加熱30min，4℃條件下以5000r·min－1離心10min。分別取上清0.2mL，在405nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組（0.1mL 2%SRBC溶于0.5mL蒸餾水中），詳見(jiàn)表1。以蒸餾水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算溶血率。以補(bǔ)體稀釋倍數(shù)為X軸，溶血百分率為Y軸作圖。選擇達(dá)到高溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補(bǔ)體濃度。

表1 補(bǔ)體經(jīng)典途經(jīng)溶血實(shí)驗(yàn)中所加各成分的體積（mL）

2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測(cè)定

取確定臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻，按照表1加入適量BBS、溶血素和2%SRBC，于37℃水浴加熱30min，4℃條件以5000r·min－1離心10min，分別取上清0.2mL，用酶標(biāo)儀在405nm下測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置多糖對(duì)照組、補(bǔ)體組和全溶血組。以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖。

3 結(jié)果

3.1 經(jīng)典途經(jīng)篩選結(jié)果

將5個(gè)不同批次稀釋補(bǔ)體加入溶血體系中，評(píng)價(jià)其效價(jià)。在補(bǔ)體稀釋濃度為1∶10～1∶40時(shí)，溶血率接近100%，體系基本達(dá)到全溶血。因此以稀釋比例為1∶40的豚鼠血清作為以下經(jīng)典途徑篩選實(shí)驗(yàn)中所使用的補(bǔ)體，見(jiàn)圖1。

圖1 經(jīng)典途經(jīng)不同稀釋度的豚鼠血清的效價(jià)（%，n＝5）

3.2 供試藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)“2.2.3”項(xiàng)下，對(duì)16種藥材的抗補(bǔ)體活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明供試藥材中蒼術(shù)的最大溶血抑制率最高，為98.2%，超過(guò)相應(yīng)濃度肝素的最大溶血抑制率，表明抗補(bǔ)體活性良好?？嘈尤实绕渌┰囁幉牡淖畲笕苎种坡拭黠@偏低，表明體外抗補(bǔ)體活性不佳。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 供試藥物抗補(bǔ)體活性

圖3 供試藥物抗補(bǔ)體活性

4 討論

目前臨床應(yīng)用非天然產(chǎn)物類(lèi)補(bǔ)體抑制劑治療各種肺纖維化，雖然對(duì)該病起到一定的治療作用，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)降低機(jī)體的防御機(jī)能，可產(chǎn)生多種副作用和并發(fā)癥。傳統(tǒng)中藥中大多數(shù)活性成分可以直接被機(jī)體消化吸收，說(shuō)明從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)出高效、低毒的補(bǔ)體抑制劑是可能的。此外，從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)的補(bǔ)體抑制劑還具有成本低的優(yōu)點(diǎn)。

本文通過(guò)對(duì)東北16種道地藥材進(jìn)行體外溶血試驗(yàn)，旨在篩選出具有一定抗補(bǔ)體活性的天然藥物。結(jié)果顯示在供試藥材中藥物濃度在0.08mg／mL時(shí)，蒼術(shù)的溶血抑制率最大，活性較好，為進(jìn)一步研究天然藥物在治療肺纖維化、開(kāi)發(fā)高效低毒天然補(bǔ)體抑制劑奠定基礎(chǔ)。

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