不同氧化應(yīng)激下p38-MAPK和STAT3對(duì)DPSCs生物性能的影響①

李 偉 黃玉萍 胡紅梅

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部口腔系，吉安 343000)

p38-MAPK和STAT3信號(hào)通路在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的作用，它們可因周圍環(huán)境的改變而激活，活化的p38-MAPK和STAT3轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，引起轉(zhuǎn)錄激活。牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)是Gronthos等[1]于2000年通過(guò)研究牙髓組織發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞，p38-MAPK和STAT3可參與DPSCs分化、凋亡及細(xì)胞周期的運(yùn)行，并可在適宜的細(xì)胞微環(huán)境中誘導(dǎo)DPSCs發(fā)生分化并形成修復(fù)性牙本質(zhì)，完成牙髓組織的生理性修復(fù)[2]。在DPSCs誘導(dǎo)分化為修復(fù)性牙本質(zhì)的分子機(jī)制研究中，對(duì)不同氧化應(yīng)激信號(hào)的研究較少，氧化應(yīng)激可消耗內(nèi)源性抗氧化酶，不同濃度的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、歸巢及再生能力都有不同的影響。一些研究表明，氧濃度降低有助于維持DPSCs的活性，但不同氧化應(yīng)激影響DPSCs生物性能的潛在分子機(jī)制還沒(méi)有被證實(shí)[3,4]。本實(shí)驗(yàn)探討了不同氧化應(yīng)激下p38-MAPK和STAT3信號(hào)通路對(duì)DPSCs增殖、礦化和成脂分化的調(diào)控情況，為臨床上牙髓組織的生理性修復(fù)的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋，日本)，低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，美國(guó))，水平脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司，江蘇)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海醫(yī)用儀器廠)，0.22 μm纖維素濾膜和0.45 μm混合纖維素濾膜(Millipore，美國(guó))，電子分析天平(Precisa，瑞士)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))，PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))，油紅O染色液試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit(Bio-Rad，美國(guó))，流式細(xì)胞檢測(cè)儀(Bio-Rad，美國(guó))， CCK-8試劑盒(Sigma，美國(guó))，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國(guó))，DMSO、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(100×)(碧云天，中國(guó))，RNAiso Plus(TaKaRa，日本)，CD34、CD45、CD146(eBioscience，美國(guó))，Stro-1(Novus，美國(guó))，SB203580和SH-4-54(Selleck，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1DPSCs酶聯(lián)合消化法原代培養(yǎng) 收集臨床上因正畸和阻生智齒而完整拔除的健康人(12～28 歲)牙齒，并經(jīng)患者本人及家屬同意，牙齒拔出以后表面 75%乙醇滅菌，置PBS 反復(fù)沖洗后立即在牙齒表面制備出兩條縱行的淺溝，深達(dá)牙本質(zhì)，并送實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)中劈開取出牙髓，用眼科剪剪去根尖部牙髓組織1 mm左右，剩余牙髓組織立即用 PBS液反復(fù)沖洗，把牙髓組織剪碎成約0.5 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，用Ⅰ型膠原酶在37℃消化15 min，使牙髓組織消化成松散的狀態(tài)，然后輕輕吹打松散的單細(xì)胞團(tuán)塊，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用DMEM培養(yǎng)液稀釋并輕輕吹打，取適量稀釋液(密度1×104～1×105)放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶到細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件控制在37℃，5%CO2，相對(duì)濕度為100%，每3 d換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間到14 d時(shí)候，細(xì)胞可生長(zhǎng)達(dá)到80%～90% 匯合， 胰酶消化收集細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，細(xì)胞凍存。

1.2.2流式細(xì)胞儀鑒定DPSCs指標(biāo) 首先復(fù)蘇細(xì)胞后用0.25%胰酶消化，并收集到離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞，然后小心吸去上清，使沉淀在下面的混合物約含50 μl的培養(yǎng)基，加入1 ml 預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，吸去上清，加入1 ml預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×107ml-1，手指輕輕彈擊離心管底部以適當(dāng)分散DPSCs，避免細(xì)胞成團(tuán)影響下一步的實(shí)驗(yàn)，然后在每個(gè)流式檢測(cè)管中加入50 μl的稀釋后的CD34、CD45、CD146、Stro-1抗體(抗體用Staining Buffer稀釋成合適的濃度)，在空白管加入50 μl Staining Buffer，并分別在各管中加入50 μl細(xì)胞懸液(約106細(xì)胞)，并輕輕混勻，冰浴或4℃冰箱中避光孵育20 min。孵育完成后，加入Staining Buffer，1 000 r/min 4℃離心5 min，并棄去上清，重復(fù)洗滌過(guò)程3次，100 μl重懸細(xì)胞后上流式儀檢測(cè)。

1.2.3CCK8檢測(cè)不同氧化應(yīng)激下DPSCs增殖 細(xì)胞模型分組：1組：常氧組，2組：SB203580處理常氧組，3組：SH-4-54處理常氧組，4組：3%O2組，5組：SB203580處理3%O2組，6組：SH-4-54處理3%O2組，7組：6%O2組，8組：SB203580處理6%O2組，9組：SH-4-54處理6%O2組，10組：9%O2組，11組：SB203580處理9%O2組，12組：SH-4-54處理9%O2組。DPSCs培養(yǎng)于含青、鏈霉素(各1 U/ml，0.1 mg/ml)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，放置在37℃、5%CO2、相對(duì)濕度為100%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105ml-1，分別接種于96孔板中，每孔100 μl，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁以后，按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，將培養(yǎng)板分別置于常氧箱和不同氧含量的培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至6 h、12 h、24 h、36 h、48 h，然后在每孔加入10 μl的 CCK-8溶液，并按照實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置空白孔(培養(yǎng)基、CCK)，對(duì)照孔(未經(jīng)處理的細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK)，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值，計(jì)算3個(gè)復(fù)孔的平均值，繪制曲線圖。

1.2.4不同氧化應(yīng)激下DPSCs礦化誘導(dǎo) 將細(xì)胞用消化液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞密度至2×104ml-1， 取細(xì)胞懸液分別滴到無(wú)菌的24孔板專用細(xì)胞爬片上，注意不要滴到爬片外，讓細(xì)胞貼片30 min左右，30 min后，在培養(yǎng)皿中補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(讓其貼壁更牢)，取出培養(yǎng)皿，用PBS漂洗2遍，每次2 min，4%多聚甲醛處理(室溫)20 min，PBS漂洗3遍，每次2 min，茜素紅染液染30 min，雙蒸水沖洗2次，拍照，在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5油紅O染色觀察DPSCs成脂誘導(dǎo) 將細(xì)胞爬片入ORO Fixative固定15 min， 取出細(xì)胞爬片，放于流通的空氣中15 min，放入新配制好的ORO Stain，浸染15 min， 入60%異丙醇漂洗30 s，流水沖洗，置入蒸餾水稍微清洗后，再浸入Mayer蘇木素染色液中，復(fù)染核2 min，放 入ORO Buffer中1 min， 流水沖洗，晾干，經(jīng)4%的多聚甲醇固定30 min，油紅O染色觀察紅染的脂肪小滴情況。

2 結(jié)果

2.1DPSCs的形態(tài)學(xué)觀察情況 牙髓組織經(jīng)酶組織塊消化法培養(yǎng)后7 d，倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞部分出現(xiàn)集落性生長(zhǎng)，細(xì)胞較小，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)纖維狀的梭形，培養(yǎng)到第10天時(shí)，細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，纖維狀細(xì)胞大且較長(zhǎng)，排列較致密，狀態(tài)較好，培養(yǎng)到第14 天時(shí)，細(xì)胞排列更加致密，細(xì)胞表現(xiàn)為較典型的旋渦狀特點(diǎn)，排列更加致密，主要以纖維狀形態(tài)為主，符合牙髓干細(xì)胞的典型形態(tài)特點(diǎn)(圖1)。

2.2DPSCs的流式細(xì)胞儀鑒定情況 流式鑒定顯示牙髓干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物Stro-1的陽(yáng)性高表達(dá)為96.85%，CD146的陽(yáng)性高表達(dá)為90.94%，CD45的陽(yáng)性低表達(dá)為1.02%，CD34的陽(yáng)性低表達(dá)為40.76%，表明培養(yǎng)的DPSCs是來(lái)源于間充質(zhì)的牙源性干細(xì)胞(圖2)。

2.3CCK8檢測(cè)不同氧化應(yīng)激下DPSCs增殖的情況 各個(gè)組的DPSCs增殖情況如圖所示(圖3)，通過(guò)SPSS17.0軟件分析，除了第1組以外，其余各組的細(xì)胞存活率在6 h、12 h、24 h、36 h和48 h差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且圖3顯示隨著氧氣含量的增加，細(xì)胞的存活率也越高，有意思的是，第1組常氧環(huán)境下隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞的存活率沒(méi)有變化，第2組常氧環(huán)境下抑制p38-MAPK時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)能促進(jìn) DPSCs細(xì)胞的存活率，而在其他各組較低氧環(huán)境中抑制p38-MAPK時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)卻減緩DPSCs細(xì)胞的存活率，提示在不同氧環(huán)境中p38-MAPK能抑制DPSCs的增殖，但在較低氧環(huán)境下隨著時(shí)間的推移抑制DPSCs增殖效果越好，在常氧環(huán)境中抑制增殖效果越差；而在不同氧環(huán)境中STAT3均能促進(jìn)各組DPSCs的存活率，并隨著時(shí)間的推移促進(jìn)DPSCs增殖效果越好，尤其在3%的微氧環(huán)境中與各組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)期的牙髓干細(xì)胞圖片(×100)Fig.1 Photographs of dental pulp stem cells in various stages(×100)

圖2 DPSCs的流式細(xì)胞儀鑒定情況Fig.2 Identification of DPSCs by flow cytometry

圖3 各個(gè)組的DPSCs增殖的情況Fig.3 Proliferation of DPSCs in each group

圖4 不同氧化應(yīng)激下DPSCs礦化誘導(dǎo)情況Fig.4 Induction of DPSCs to mineralization under different oxidative stress

圖5 茜素紅染色定量分析Fig.5 Quantitative analysis by alizarin red stainingNote: Compared with the normal oxygen group treated with SH-4-54,*.P<0.05;Compared with SB203580 treatment group of 9%O2,#.P<0.05.

2.4不同氧化應(yīng)激下DPSCs礦化誘導(dǎo)情況 茜素紅染色結(jié)果鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，常氧組的礦化結(jié)節(jié)較氧氣含量為3%、6%與9%組礦化結(jié)節(jié)形成的更少，3個(gè)常氧組的染色均較淺，礦化結(jié)節(jié)形成也明顯減少，而且隨著氧氣含量的增加，礦化結(jié)節(jié)形成也逐漸減少，3%的氧氣含量且抑制STAT3的礦化結(jié)節(jié)最多，染色也最深，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量和統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，3%的氧氣含量組與其他組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同茜素紅染色的結(jié)果一致，提示p38-MAPK信號(hào)通路和STAT3可能參與DPSC定向分化的過(guò)程，p38-MAPK信號(hào)通路在其中很可能發(fā)揮正向調(diào)控的作用，而 STAT3信號(hào)通路可能參與負(fù)向調(diào)控的作用(圖4)，1～12組茜素紅染色定量分析OD值分別為1.523 2、1.521 0、1.652 4、1.876 1、1.421 5、2.785 1、1.601 2、1.231 3、2.511 2、1.512 3、1.498 1、2.256 5(圖5)。

圖6 油紅O染色觀察DPSCs成脂誘導(dǎo)情況Fig.6 Lipogenic induction of DPSCs by Oil-Red O dyeing

2.5油紅O染色觀察DPSCs成脂誘導(dǎo)分析 在倒置顯微鏡下觀察DPSCs成脂誘導(dǎo)，第5代DPSCs細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)液的作用下，各組均可見(jiàn)小泡聚集而形成的脂滴狀物質(zhì)，并有部分已經(jīng)融合，油紅O染色呈陽(yáng)性，常氧環(huán)境下各組的脂滴狀物質(zhì)均較多，SH-4-54處理的3%O2、6%O2、9%O2組脂滴狀物質(zhì)逐漸減少，染色也較淺，而SB20358處理的3%O2、6%O2、9%O2組脂滴狀物質(zhì)逐漸增多，染色也較深，提示p38-MAPK信號(hào)通路和STAT3可能參與DPSCs脂向分化的過(guò)程，p38-MAPK信號(hào)通路在其中很可能發(fā)揮著負(fù)向調(diào)控的作用，而 STAT3信號(hào)通路可能參與正向調(diào)控的作用(圖6)。

3 討論

DPSCs是Gronthos等[1]于2000年通過(guò)研究牙髓組織發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞，屬于未分化的間充質(zhì)細(xì)胞并具有干細(xì)胞性質(zhì)和多向分化潛能，它們具有較高的繁殖能力和多向分化的免疫表型。國(guó)內(nèi)陸群等[5]已經(jīng)成功地分離培養(yǎng)出了大鼠牙髓干細(xì)胞，這為牙齒組織工程化研究提供理論依據(jù)和可靠的細(xì)胞來(lái)源。我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)酶組織塊消化法培養(yǎng)DPSCs后7 d，倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)典型的DPSCs形態(tài)，出現(xiàn)集落性生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)纖維狀的梭形，排列較致密，主要以纖維狀形態(tài)為主，符合DPSCs的形態(tài)特點(diǎn)。臨床上當(dāng)牙齒發(fā)生損傷后，DPSCs在牙髓中心募集，大量增殖并歸巢到損傷部位形成保護(hù)牙髓的修復(fù)性牙本質(zhì)層，最終對(duì)牙損傷進(jìn)行生理性修復(fù)。在牙損傷后的生理性修復(fù)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)通路同時(shí)被激活，其中較為重要的是p38-MAPK和STAT3信號(hào)通路，這兩種信號(hào)通路在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)通路協(xié)同、抑制細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的生成方面具有重要作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn) p38-MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細(xì)胞的分化調(diào)控，Ye等[6]發(fā)現(xiàn)p38-MAPK信號(hào)通路可促進(jìn)DPSCs的增殖和分化過(guò)程，并參與調(diào)控了DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化；Wang等[7]研究也認(rèn)為p38-MAPK信號(hào)通路參與了DPSCs內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)DPSCs的分化指標(biāo)堿性磷酸酶活性具有調(diào)控作用，提示 MAPK 信號(hào)通路在牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體損傷修復(fù)過(guò)程中具有重要作用。近期Zhou等[8]研究表明STAT3信號(hào)通路也參與了DPSCs增殖和分化的調(diào)控，且通過(guò)STAT3信號(hào)通路抑制DPSCs的分化。DPSCs的微環(huán)境中的氧氣含量的變化會(huì)影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和修復(fù)等生物學(xué)進(jìn)程，以往對(duì)DPSCs的體外研究多是在常氧(體積分?jǐn)?shù) 21%)條件下進(jìn)行，然而人體內(nèi)很多部位的實(shí)際氧濃度偏低，因此觀察低氧環(huán)境下DPSCs生物學(xué)性狀對(duì)最終理解體內(nèi)環(huán)境下其損傷修復(fù)機(jī)制具有重要意義。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，不同氧環(huán)境中p38-MAPK能抑制DPSCs的增殖，但在較低氧環(huán)境下隨著時(shí)間的推移抑制DPSCs增殖效果越好，在常氧環(huán)境中抑制增殖效果越差，而在不同氧環(huán)境中STAT3均能促進(jìn)各組DPSCs的存活率，并隨著時(shí)間的推移促進(jìn)DPSCs增殖效果越好，表明MAPK的活性對(duì)DPSCs的增殖有很大的影響，尤其在組織中的微環(huán)境中對(duì)DPSCs的增殖有抑制作用；而在p38-MAPK信號(hào)通路和STAT3信號(hào)通路參與DPSCs礦化誘導(dǎo)分化的研究中，p38-MAPK信號(hào)通路在其中很可能發(fā)揮著正向調(diào)控的作用，而 STAT3信號(hào)通路可能參與負(fù)向調(diào)控的作用，而在成脂誘導(dǎo)分化的研究中，兩者作用卻相反。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)常氧環(huán)境下DPSCs的存活率較高，具有良好的增殖能力和多向分化潛能的特點(diǎn)，可應(yīng)用于牙本質(zhì)-牙髓再生、組織工程等臨床醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，MAPK信號(hào)通路和STAT3信號(hào)通路對(duì)DPSCs的調(diào)控作用也不同，從而導(dǎo)致DPSCs增殖及分化不同，形成的修復(fù)性牙本質(zhì)的能力也不同。