抗HBV-DC聯(lián)合藥物治療e抗原陽性的臨床研究

劉勇 吳邦富 胡媛媛

[摘要]目的 觀察HBsAg致敏自體外周血單個核細(xì)胞（PBMC）來源的樹突狀細(xì)胞聯(lián)合拉米夫定和胸腺肽α1治療HBeAg陽性慢乙肝的臨床效果。 方法 HBeAg陽性CHB患者20例接受臨床研究。取肝素抗凝外周靜脈血50mL，以密度梯度離心及貼壁法獲得PBMC，GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)擴(kuò)增DC，第6天給予30 μg的HBsAg致敏DC，第7天收獲抗HBV-DC。聯(lián)合拉米夫定和胸腺肽α1，分別于0、4、12周檢測HBVM定量和HBV-DNA定量及肝功能。 結(jié)果 全部患者治療后4、12周的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA均明顯下降。總有效率100%（20/20）。 結(jié)論 抗HBV-DC聯(lián)合拉米夫定和胸腺肽α1治療，可快速降低血中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，促進(jìn)HBeAb的產(chǎn)生，提高HBeAg/HBeAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)換率。

[關(guān)鍵詞] 樹突狀細(xì)胞；慢性乙型肝炎；乙肝疫苗

[中圖分類號] R512.62[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）01-077-03

Preliminary clinical study of anti-HBV-DC combine lamivudine and thymosin α1 treat the HBeAg positive chronic hepatitis B patients

LIU Yong WU Bangfu HU Yuanyuan

Gastroenterology and Hepatology Center, Southern Medical University Renkang Hospital, Dongguan 523952, China

[Abstract] Objective To observe the clinical treatment effects of the HBsAg pulsed autologous dendritic cells derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) combine lamivudine and Thymosin-α1 for the HBeAg positive chronic hepatitis B patients. Methods Twenty patients with HBeAg positive CHB accepted by clinical research. Taking peripheral venous blood 50mL, by density gradient centrifugation and adhesion method to obtain PBMC, GM-CSF and IL-4 induced expansion of DC. At the sixth days, a 30 μg HBsAg was give to pulse the DC. At the seventh days, the anti-HBV-DCs. All patients were Lamivudine dosed every day, and were injected thymosin-α1 by subcutaneous, The HBVM, HBV-DNA and liver function were respectively detected at 0,4,12 weeks. Results At 0,4,12 weeks, the serum HBsAg levels, the serum HBeAg levels and the serum HBV-DNA levels were significantly decreased.The total effective rate was 100% (20/20). Conclusion The anti-HBV-DC by subcutaneous and intravenous injection combine lamivudine and Thymosin-α1 can decrease rapid the serum HBsAg, HBeAg and HBV-DNA levels, promote to the HBeAb production, and enhance the HBeAg/HBeAb seroconversion rate.

[Key words] Pulsed autologous dendritic cells; HBsAg; Hepatitis B vaccine

機(jī)體免疫系統(tǒng)對HBV產(chǎn)生免疫耐受是人感染HBV后慢性化的主要原因。形成免疫耐受的原因可能有多種因素參與，而樹突狀細(xì)胞的功能缺陷是形成免疫耐受的重要原因之一。以HBsAg致敏自體外周血單個核細(xì)胞來源的DC治療慢性HBV感染者已取得一定的效果。我們前期的臨床研究也證實[1]，負(fù)載HBsAg的抗HBV-DC可以快速降低或清除慢性HBV感染者的病毒抗原，促進(jìn)HBeAb的產(chǎn)生，加速HBeAg/HBeAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。但是，在抑制病毒復(fù)制和減少病毒載量方面相對緩慢。目前廣泛使用的核苷類抗病毒藥物可以快速抑制HBV復(fù)制和降低病毒載量，但在降低或清除病毒抗原、促進(jìn)HBeAb的產(chǎn)生和促進(jìn)HBeAg/HBeAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)換方面較緩慢。胸腺肽α1具有增強(qiáng)非特異性免疫功能，是目前唯一被推薦用于慢乙肝治療的免疫調(diào)節(jié)類藥物，但是單獨應(yīng)用的療效較差。為提高以抗HBV-DC為主的免疫治療方法的臨床效果，我們在應(yīng)用抗HBV-DC治療的同時，聯(lián)合應(yīng)用拉米夫定和胸腺肽α1治療HBeAg陽性CHB患者，取得了較好的效果，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1 研究對象

根據(jù)2000年9月西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》和2005年12月制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]的標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取南方醫(yī)科大學(xué)仁康醫(yī)院2010年6～12月住院的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者20例，其中男15例，女5例，年齡15～45歲，平均30歲。病程1～20年，均為輕度的慢性乙型肝炎患者。ALT：（46～276） U/L，ALT≤2倍正常值者11例，ALT＞2倍者9例，平均101.85 U/L。1例為HBsAg、HBeAg及HBV-DNA陽性；19例為HBsAg、HBeAg、HBcAb及HBV-DNA陽性，其中1例合并丁型肝炎病毒（HDV）感染，HDV-IgM和HDV-RNA陽性。

試驗符合南方醫(yī)科大學(xué)仁康醫(yī)院人體臨床試驗倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。試驗開始前所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 抗HBV-DC培養(yǎng)方法

取患者肝素抗凝的外周靜脈血50 mL，以密度梯度離心及貼壁法獲得單個核細(xì)胞。在37 ℃、5%CO2濃度的條件下，用含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素4等細(xì)胞因子的RPMI1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)PBMC中的貼壁細(xì)胞，擴(kuò)增出DC。于培養(yǎng)第6天給予含有30 μg HBsAg的商用乙型肝炎疫苗致敏DC，使其成為具有特異性治療CHB的DC疫苗，簡稱抗HBV-DC；于培養(yǎng)第7天收獲DC，并以生理鹽水洗滌2次，獲得（0.5～1.0）×106的抗HBV-DC，以2 mL生理鹽水懸浮備用。

1.3 治療方案

將以2 mL生理鹽水懸浮的抗HBV-DC皮下和靜脈各注射1 mL，每2周1次，共6次。拉米夫定（安徽貝克，批號：101102）100 mg/日，口服。胸腺肽a1（海南中和，批號：H20051916）1.6 mg皮下注射，每周2次，共24次。所有患者均不使用降酶藥物。

1.4 標(biāo)本檢測

于治療開始的0、4、12周，即抗HBV-DC回輸前、回輸2次和6次后的第14天，分別以時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA）檢測HBV標(biāo)志物（HBVM）定量，以熒光定量PCR檢測HBV-DNA定量，同時檢測ALT及總膽紅素（TBIL）等肝功能指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用治療前后自身對照，以SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以（χ±s）表示，差異顯著性檢驗采用配對樣本t檢驗，確定當(dāng)P＜0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后HBVM及HBV-DNA定量改變

所有患者在治療4周和12周時的血清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平均較治療前明顯下降。4周時，HBsAg平均下降65.83%，無HBsAg轉(zhuǎn)陰；HBeAg平均下降78.95%，其中7例HBeAg轉(zhuǎn)陰（35%），但這7例中有1例在12周時HBeAg又轉(zhuǎn)陽；HBV-DNA平均下降2.15個對數(shù)值。12周時，HBsAg平均下降77.79%，仍無HBsAg轉(zhuǎn)陰；HBeAg平均下降83.11%，另有3例HBeAg轉(zhuǎn)陰，共有9例HBeAg轉(zhuǎn)陰（45%）；HBV-DNA平均下降2.26個對數(shù)值。

4周時，有12例HBeAb較治療前升高，其中9例HBeAb轉(zhuǎn)陽(45%)，但這9例中有4例在12周時HBeAb又轉(zhuǎn)陰；另3例升高者中有2例在12周時HBeAb轉(zhuǎn)陽。1例4周時HBeAb下降為零，12周時又升高，但未轉(zhuǎn)陽。7例4周時HBeAb無變化，治療前后均為零，但這7例中有4例在12周時HBeAb升高，其中2例轉(zhuǎn)陽。12周時共有9例HBeAb轉(zhuǎn)陽(45%)，見表1。

2.2 應(yīng)答反應(yīng)

4周時，出現(xiàn)單項病毒學(xué)應(yīng)答者14例（70%）,其中HBV-DNA轉(zhuǎn)陰11例（55%），下降3例。6例出現(xiàn)HBeAg/HBeAb血清學(xué)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換率30%（6/20），1例在12周時又出現(xiàn)HBeAg轉(zhuǎn)陽和HBeAb轉(zhuǎn)陰。5例出現(xiàn)單項生化學(xué)應(yīng)答，ALT恢復(fù)正常（25%）。共有17例出現(xiàn)部分應(yīng)答（85%），無完全應(yīng)答者。

12周時，另有4例出現(xiàn)單項病毒學(xué)應(yīng)答者，其中HBV-DNA轉(zhuǎn)陰和下降各2例，18例出現(xiàn)單項病毒學(xué)應(yīng)答者（90%），其中HBV-DNA轉(zhuǎn)陰13例（65%）。另有4例出現(xiàn)HBeAg/HBeAb血清學(xué)轉(zhuǎn)換，9例出現(xiàn)HBeAg/HBeAb血清學(xué)轉(zhuǎn)換，總的轉(zhuǎn)換率為45%（9/20）。另5例出現(xiàn)單項生化學(xué)應(yīng)答，ALT恢復(fù)正常，10例ALT恢復(fù)正常（50%）。12周時7例出現(xiàn)完全應(yīng)答（35%），13例出現(xiàn)部分應(yīng)答（65%），總應(yīng)答率（有效率）為100%（20/20）。

2.3 肝功能改變與應(yīng)答的關(guān)系

治療4周時，17例ALT較前下降，其中5例ALT降至正常。3例較前升高，但12周時下降。治療12周時，所有患者的ALT均較治療前下降，其中10例ALT降至正常。

4周時出現(xiàn)HBeAg/HBeAb血清學(xué)轉(zhuǎn)換的6例中，2例治療前ALT＞2倍正常值，4例ALT≤2倍正常值，但是，這4例中1例在12周時再轉(zhuǎn)為HBeAg陽性和HBeAb陰性。12周時達(dá)到HBeAg/HBeAb血清學(xué)轉(zhuǎn)換的9例中，5例治療前ALT＞2倍正常值，占ALT＞2倍正常值患者的55.56%（5/9）；4例ALT≤2倍正常值，占ALT≤2倍正常值患者的36.36%（4/11）。

2.4 不良反應(yīng)

抗HBV-DC皮下注射后2例次出現(xiàn)注射部位的皮膚紅腫，未做特殊處理，數(shù)日后自行消退?？笻BV-DC注射后4例次出現(xiàn)頭痛和輕、中度發(fā)熱，均未做任何處理，次日消退。總的不良反應(yīng)率為5%。沒有患者因為不能耐受的不良反應(yīng)而停止治療。

3 討論

已知的樹突狀細(xì)胞（DC）是人體最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，它專職負(fù)責(zé)攝取、加工、處理及傳遞病原微生物及癌變細(xì)胞等非己抗原的信息給下一級免疫細(xì)胞，啟動機(jī)體的抗感染及抗腫瘤免疫，因此，DC是機(jī)體抗感染及抗腫瘤的免疫啟動者。國內(nèi)外大量的基礎(chǔ)研究表明，乙肝的慢性化與人體的免疫系統(tǒng)對乙肝病毒發(fā)生免疫耐受有關(guān)[3]，而免疫耐受主要原因是慢性乙肝病毒的DC功能低下，主要表現(xiàn)為不成熟，不能有效地將乙肝病毒感染的信息傳遞給T淋巴細(xì)胞，也不能有效地為T淋巴細(xì)胞的活化提供刺激信號，使免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生特異性地細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和特異性抗體來清除乙肝病毒，導(dǎo)致乙肝的慢性化。通過體外培養(yǎng)技術(shù)，可以獲得大量活化、功能基本正常并攜帶乙肝病毒抗原信息的DC。將其回輸后可以使免疫系統(tǒng)重新恢復(fù)對乙肝病毒的免疫識別，安全或者部分打破免疫耐受，重啟抗乙肝病毒的免疫反應(yīng)

人體臨床實驗表明：以HBsAg致敏慢性HBV感染者PBMC來源自體DC細(xì)胞，將該DC回輸患者，顯示能夠抑制HBV的復(fù)制[4]，部分患者HBV-DNA、HBsAg及HBeAg轉(zhuǎn)陰。早期臨床研究顯示[6]，體外誘導(dǎo)擴(kuò)增慢性HBV感染者自身PBMC來源的DC并經(jīng)HBsAg致敏后使其成為具有特異性治療慢性HBV感染的抗HBV-DC，將其靜脈回輸，可有效地抑制慢性HBV感染者的病毒復(fù)制，減少病毒載量，顯著降低或者清除病毒HBsAg和HBeAg，促進(jìn)HBeAb產(chǎn)生，促進(jìn)HBeAg/HBeAb的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，部分乙肝患者徹底治愈。慢性乙型肝炎HBeAg陽性患者可對抗HBV-DC的治療發(fā)生良好的應(yīng)答反應(yīng)[6]，是一種安全有效的治療慢性HBV感染者的免疫學(xué)治療方法，顯示出良好的應(yīng)用前景。將抗HBV-DC回輸技術(shù)與核苷類似物和胸腺肽α1等藥物聯(lián)合應(yīng)用[7]，發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)一步提高療效，明顯高于單純藥物治療的療效。

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（收稿日期：2011-10-21）