草坪草褐斑病菌粗毒素液對寄主葉片防御酶體系的影響

孫淑琴 李榮華 楊秀榮 田濤

摘要：分別利用草坪草褐斑病菌粗毒素5倍稀釋液和10倍稀釋液接種盆播坪草高羊茅，1周內逐天采集處理葉片，測定葉片防御酶(PAL,POD、PPO、CAT)活性變化。結果表明，坪草高羊茅葉片經(jīng)粗毒素液處理1周內，PAL,POD、PPO活性較對照均有不同程度的提高，其總體變化趨勢為先升高后降低，并且高濃度毒素處理較低濃度毒素處理的酶活性高，而經(jīng)毒素處理后的坪草葉片CAT酶活性較對照卻呈現(xiàn)下降的趨勢。

關鍵詞：草坪草褐斑病菌；粗毒素；防御酶

中圖分類號：S436.8文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0087-04

由絲核菌屬(Rhizoctonia spp.)病原引起的草坪草褐斑病是世界上報道最早、分布最廣、危害最重的草坪草病害之一。植株受害部位常為葉片、葉鞘和莖，發(fā)病初期，染病部位呈現(xiàn)梭形、長條形或不規(guī)則形水漬狀病斑，后病斑中心枯白，邊緣變褐，最后葉片干枯萎蔫。受害草坪初期常出現(xiàn)大小不等的近圓形枯草斑，條件適合時，病情快速蔓延，枯草斑直徑從幾厘米迅速擴大到2m左右，嚴重影響草坪的觀賞價值和實用價值。

目前，有關草坪草褐斑病的研究大多集中于病害的識別、病原鑒定及防治藥劑的篩選等研究，而對于病原菌與寄主之間互作的研究相對較少。大量研究表明，絲核菌的致病因子——毒素在致病過程中起重要作用，與寄主的致病力存在顯著正相關，但報道多見于水稻等大田作物，而有關草坪草的研究尚未見相關報道。為進一步明確草坪草褐斑病病原的致病機理及病原與寄主的互作關系，本研究從病原菌代謝產(chǎn)物——毒素出發(fā)，研究不同濃度毒素處理對寄主體內防御酶體系的影響，明確寄主應對毒素所做出的生理反應，以期為病原菌的致病機理研究提供參考，并為病害的防治提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1供試材料

供試草坪草品種：高羊茅“火鳳凰”。供試菌株：褐斑病病原RH2菌株，經(jīng)鑒定為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)。

1.2試驗方法

1.2.1粗毒素液的制備將RH2菌株在PDA平板中擴大培養(yǎng)1周后，用直徑0.5cm打孔器在菌落邊緣打孔，挑取5塊菌盤接種于150ml Ps液體培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)20d。培養(yǎng)液2層濾紙過濾后，收集培養(yǎng)濾液。

培養(yǎng)濾液加入等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液經(jīng)旋轉蒸發(fā)去掉乙酸乙酯，殘留的棕褐色物質即為粗毒素。由于乙酸乙酯對草坪葉片有輕微的毒性(經(jīng)試驗)，所以粗毒素用有機溶劑甲醇溶解。

1.2.2接種方法盆播苗出苗約1個月后接種。分別將粗毒素液稀釋成5倍和10倍液作為接種體，甲醇為空白對照。分別將各接種體噴霧接種于葉片上，塑料薄膜保濕24h。試驗共設3個處理，每處理重復3次。分別于接種后1、2、3、4、5、6d用滅菌剪刀剪下中上部葉片收集，各處理重復3次的葉片剪碎后混勻，冷凍保藏。

1.2.3酶粗提液的制備過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)提取：取采集葉片0.05g，放入研缽中，加入0.01g PVP，再加入0.05mol/L預冷的磷酸緩沖液(pH7.8)1.2ml，分3次加入，冰浴研磨成勻漿，將勻漿全部轉入離心管中，4℃ 12000 r/min冷凍離心30min，上清液即為酶粗提取液。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)提?。喝〔杉~片0.05g，放入研缽中，加入0.01g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入5mmol/L巰基乙醇硼酸緩沖液(pH8.8)1.2ml，分3次加入，冰浴研磨成勻漿，將勻漿全部轉入離心管中，4℃ 12000r/min冷凍離心30min，上清液即為酶粗提取液。

1.2.4酶活性測定

(1)PAL活性測定

反應體系為：0.1mol/L、pH 8.8的硼酸緩沖液2ml，0.02mol/L的L-苯丙氨酸1ml，酶液0.6ml。將測定管放在30℃恒溫水浴鍋中保溫45min，取出立即加入6mol/L的鹽酸1.0ml終止反應，測定290nm處的吸光值?？瞻讓φ找跃彌_液代替酶液，每樣品重復3次，以每分鐘OD₂₉₀變化0.01為一個酶活單位。

(2)POD活性測定

反應體系為：pH7.8磷酸緩沖液2.9ml，2％過氧化氫(現(xiàn)用現(xiàn)配)1.0ml，0.05mol/L愈創(chuàng)木酚1.0ml，酶液0.08ml，反應體系加入酶液后混勻測定OD₄₇₀，每1min讀數(shù)1次，讀3min內的變化值，空白對照以緩沖液代替酶液，每樣品重復3次，以每分鐘OD₄₇₀變化0.01為一個酶活單位。

(3)PPO活性測定

反應體系為：pH 7.8磷酸緩沖液2.0ml，0.1mol/L鄰苯二酚1ml，酶液0.5ml，反應體系加入酶液后在37℃恒溫水浴鍋中保溫1h，取出立即加入20％的三氯乙酸2.0ml終止反應，紫外分光光度計測定OD₄₂₀，空白對照以緩沖液代替酶液，每樣品重復3次，以每分鐘OD₄₂₀變化0.01為一個酶活單位。

(4)CAT活性測定

反應體系為：pH 7.8磷酸緩沖液4.0ml，2％過氧化氫0.16ml，酶液0.4ml，反應體系加入酶液后立即開始計時，并測定OD₂₄₀，每10s讀數(shù)1次，讀1min內的變化值，空白對照以緩沖液代替酶液，每樣品重復3次，以每分鐘OD₂₄₀變化0.01為一個酶活單位。

2.結果與分析

2.1PAL活性變化

如圖1所示(酶活值為3次重復的平均值，以下均同)，接種毒素1d后，PAL活性顯著升高，5倍、10倍稀釋液處理較對照分別增加33.3％和36.7％。3d后又下降至最低水平。后又迅速升高，5d后達到最高峰。整體水平來看，接種不同濃度毒素處理的PAL活性變化趨勢基本一致，其中5倍稀釋液處理PAL活性高于10倍稀釋液，且都明顯高于對照。

2.2POD活性變化

如圖2所示，5倍稀釋毒素液接種后，POD活性顯著高于對照，出現(xiàn)先升高后降低2個高峰。而接種10倍稀釋毒素液處理的POD活性整體呈現(xiàn)下降的趨勢，但5d后又急劇上升。對照處理POD活性在1周內變化不大，呈現(xiàn)相對穩(wěn)定的趨勢。

2.3PPO活性變化

由圖3可知，接種處理1d后，5倍、10倍稀釋液處理PPO活性均明顯高于對照，分別高出22.1％和59.2％。1d后，5倍稀釋液處理PPO活性出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，共出現(xiàn)2個高峰。而10倍稀釋液處理的PPO活性急劇下降，3d后降低到最低水平，后又急劇升高，5d時達到最高峰。從整體水平看，接種毒素處理后，寄主PPO活性明顯升高。

2.4CAT活性變化

由圖4可知，毒素處理后，CAT活性較對照明

顯下降。毒素處理后1～4d，10倍稀釋液毒素處理CAT活性從最低值一直處于緩慢上升階段，4d后迅速升高。而5倍稀釋液毒素處理的葉片內CAT活性是迅速升高而后又迅速降低，4d時為最低，后又迅速上升。2個處理問相比較，5倍稀釋液處理CAT活性較10倍稀釋液處理較高，4d后都處于平穩(wěn)上升階段。而對照處理CAT活性明顯高于毒素處理，3d后處于平穩(wěn)下降趨勢。

3.討論與結論

在正常狀態(tài)下，由于植物體內防御酶(如SOD、POD、CAT等)等活性氧清除系統(tǒng)的存在，使活性氧代謝處于低水平動態(tài)平衡之中。但如果植物遭受到外界不良因素的影響后，植物體內的防御酶活性會發(fā)生相應的變化，以增強植株的抗逆性，最大限度地適應不良環(huán)境。

眾多試驗表明，接種病原菌的致病因子后，寄主做出的生理反應和接種病原菌后寄主的生理反應是相似或相同的，這也進一步揭示了病原菌的致病機理。

本研究表明，草坪草葉片接種病原菌粗毒素液后，寄主葉片內POD、PPO、PAL活性較對照都有不同程度的提高，并且高濃度毒素處理較低濃度毒素處理酶活性維持較高水平，說明粗毒素液作用寄主后，寄主啟動防御酶系統(tǒng)抵制不良侵害，并且侵害程度越大，防御酶活性提高得越多。這進一步證實了草坪草褐斑病菌的致病因子可能為毒素。徐艷(2006)利用水稻紋枯病菌粗毒素(稀釋20～100倍)處理水稻葉片和葉鞘后，POD、PPO、PAL、SOD活性較對照都有不同程度的升高，并且隨著毒素處理時間的延長，這些酶活性不斷增強。其結論與本試驗結論一致，原因可能為：水稻和禾本科草坪草同屬于禾本科作物，寄主內的防御酶系統(tǒng)可能相同或相近，所以同種病原菌因子處理后，寄主體內防御酶系統(tǒng)應答反應相近。本試驗毒素處理后，CAT活性較對照有明顯下降的趨勢，分析其原因可能是由于毒素處理后，葉片內活性氧迅速增加，為了消除過量活性氧帶來的傷害，在一定程度上消耗了一定的酶活，使其活性降低。

總之，褐斑病菌粗毒素液處理坪草葉片后，葉片防御酶活性發(fā)生了一系列變化，這在一定程度上反映了病原菌毒素侵染寄主后，寄主在生理上做出的應答反應，揭示了病原菌毒素在致病過程中的作用，為病原菌和寄主互作及病原菌致病機理研究提供了理論依據(jù)。在寄主一病原物互作中，由于植物、病原菌的遺傳背景各不相同，各種酶的特性也不盡相同，因此在研究不同的植物與不同的病原菌互作中，寄主防御酶系統(tǒng)也可能會發(fā)生不同的變化。

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