轉(zhuǎn)Bt基因玉米葉片中Bt蛋白的表達(dá)和分泌研究

田曉燕 趙蕾 孫紅煒 李凡 趙輝 顏世磊 路興波

摘要：以轉(zhuǎn)Bt玉米Mon810及其親本非轉(zhuǎn)基因玉米為研究對(duì)象，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)定量檢測(cè)Mon810玉米葉中Bt蛋白表達(dá)量和葉表Bt蛋白分泌量，結(jié)果表明葉組織和葉表均可檢測(cè)到Bt蛋白，組織內(nèi)Bt蛋白量從苗期到抽絲期隨著植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的加快呈上升趨勢(shì)，至抽絲期達(dá)到頂峰，之后逐漸降低；葉表Bt蛋白分泌量變化無(wú)明顯規(guī)律性。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)；轉(zhuǎn)基因玉米；Bt蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：Q783文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942(2012)01-0011-03

玉米螟(Pyrausta nubilalus)是我國(guó)玉米的主要蟲(chóng)害之一，可危害玉米植株地上的各個(gè)部位，使受害部位喪失功能，降低籽粒產(chǎn)量，廣泛分布在北京、東北、河北、山東、廣西、四川等地，近年來(lái)危害日趨嚴(yán)重。

1990年美國(guó)Monsanto公司用基因槍法獲得了能正常結(jié)實(shí)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米，使玉米自身能夠合成殺蟲(chóng)物質(zhì)，防治目標(biāo)害蟲(chóng)。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米可以減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑的用量和提高玉米產(chǎn)量，是防治玉米螟危害的有效手段之一，但是其對(duì)生態(tài)環(huán)境潛在的不利影響也不能忽視。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt玉米的根系能夠向土壤中分泌CrylAb毒蛋白，而且該毒蛋白能很快與土壤基質(zhì)結(jié)合，較之游離態(tài)更難被生物降解，對(duì)土壤微生物和生態(tài)造成影響。另外，有報(bào)道稱(chēng)轉(zhuǎn)基因玉米花粉在一定的濃度下可以使黑鳳蝶存活率明顯下降，也有一些室內(nèi)及田間試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米花粉對(duì)非目標(biāo)害蟲(chóng)的存活率無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)在大田環(huán)境下對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因玉米Mon810不同發(fā)育時(shí)期的Bt蛋白表達(dá)量及葉表Bt蛋白分泌量進(jìn)行測(cè)定，旨在為轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)和有效利用其抗蟲(chóng)特性提供理論參考和依據(jù)。

1.材料與方法

1.1供試材料

供試玉米品種為孟山都公司的Mon810(品種為DK647BTY，表達(dá)CrylAb殺蟲(chóng)蛋白)及其非轉(zhuǎn)Bt親本玉米DK647。2010年6月中旬播種，試驗(yàn)田統(tǒng)一施肥和灌水，試驗(yàn)期間不噴施任何農(nóng)藥，其他管理措施同常規(guī)大田。在玉米的苗期、拔節(jié)期、喇叭口期、抽雄期、抽絲期、乳熟期和完熟期分別按照五點(diǎn)取樣法采摘充分伸展開(kāi)的葉片；Bt-CrylAb酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葉組織Bt蛋白表達(dá)量的測(cè)定Bt蛋白的提?。?ml離心管加0.15g經(jīng)液氮充分研磨的葉組織和1.5ml PBST提取緩沖液；渦旋使之充分混勻，靜置30min，離心10min(12000 r/min)，取上清液20μl，用提取液稀釋一定的倍數(shù)(50倍或100倍)待測(cè)。

Bt蛋白的定量測(cè)定：按照Bt-CrylAb酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明的方法進(jìn)行。加100μl樣品提取液于待測(cè)樣品孔中，保鮮膜覆蓋，200r/min振蕩15min，于保濕瓷盒中室溫孵育2h；用PBST緩沖液洗板，重復(fù)5次，之后每個(gè)微孔中加100μlCrylAb-enzyme conjugate，保鮮膜覆蓋，200 r/min振蕩15min，保濕瓷盒中室溫孵育2h；去膜，PBST緩沖液沖洗3次，每一個(gè)微孔中加100μl的底物，保鮮膜覆蓋，室溫孵育15min；最后加50μl終止液，充分混勻，30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定其450nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出Bt蛋白的含量，換算為每克鮮重含有的Bt蛋白量。

1.2.2葉表Bt蛋白分泌量的測(cè)定Bt蛋白的提?。合扔脽o(wú)菌水將葉面輕輕沖洗3遍，將2.0g葉片和20ml PBST提取液放入錐形瓶中，200 r/min振蕩30min，靜置10min后取上清20μl，用提取液稀釋一定的倍數(shù)(50倍或100倍)待測(cè)。

Bt蛋白的定量測(cè)定：葉表Bt蛋白分泌量的測(cè)定方法同上。

1.2.3可溶性蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮蘭G250法(Bradford法)測(cè)定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，分光光度計(jì)測(cè)定其OD₅₉₅值。

2.結(jié)果與分析

2.1不同生育期Mon810葉片中Bt蛋白表達(dá)量分析

對(duì)Mon810不同發(fā)育階段Bt蛋白表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果(表1)表明，苗期～喇叭口期Bt蛋白表達(dá)量呈緩慢上升趨勢(shì)，不同生育期間無(wú)顯著差異；喇叭口期～抽絲期，Bt蛋白表達(dá)量顯著增加，至抽絲期達(dá)到最高峰，之后開(kāi)始下降，完熟期Bt蛋白表達(dá)量顯著低于抽絲期(P<0.05)。

Bt晶體蛋白占可溶性總蛋白的量在一定程度上反映了不同時(shí)期植株Bt基因表達(dá)程度的強(qiáng)弱，可視為Bt基因的表達(dá)強(qiáng)度。從表1可知，Bt基因的表達(dá)強(qiáng)度于拔節(jié)期最高，隨后開(kāi)始下降，抽絲期和乳熟期Bt基因的表達(dá)強(qiáng)度有所提高，完熟期又有所下降。

2.2不同生育期Mon810葉表Bt蛋白分泌量分析

由表1可知，從苗期到完熟期，Mon810葉面分泌物中均可檢測(cè)到CrylAb毒蛋白，分泌量在0.20-0.27μg/gFW，占Bt蛋白表達(dá)量的1.35％～2.20％，生育期之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。乳熟期和完熟期的Bt分泌量略高于生育前期，葉片的老化可能是導(dǎo)致Bt分泌量增加的主要原因。

3.小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Mon810葉片中的Bt蛋白表達(dá)量隨著生育期進(jìn)程而增加，至抽絲期達(dá)到最大，之后又開(kāi)始下降。完熟期的Bt蛋白表達(dá)量顯著低于抽絲期，可能與株體的老化有關(guān)。Bt基因的表達(dá)強(qiáng)度在拔節(jié)期最高，乳熟期和抽絲期次之，推測(cè)表達(dá)強(qiáng)度的提高可以提高中后期玉米螟危害最嚴(yán)重時(shí)期的抗性。這與李蔥蔥等的研究結(jié)果相似。

國(guó)內(nèi)外許多研究表明，Bt蛋白可與作物的根系分泌物一起被分泌到土壤中，本試驗(yàn)的ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米亦可通過(guò)葉表分泌專(zhuān)一性Bt蛋白。但分泌量在整個(gè)生育期呈現(xiàn)不規(guī)律波動(dòng)，原因可能有二：第一，Bt蛋白作為碳源和氮源被微生物降解利用，因此推測(cè)Bt蛋白不會(huì)在環(huán)境中長(zhǎng)期積累；第二，大田試驗(yàn)受很多自然因素的影響，葉表Bt蛋白量的波動(dòng)可能與采樣前的氣候，如降雨量等有關(guān)。

需要指出的是，我們從陰性對(duì)照材料的葉組織內(nèi)和葉表分泌物中都未檢測(cè)到Bt蛋白的存在，這說(shuō)明我們的試驗(yàn)結(jié)果是可靠的，可為轉(zhuǎn)基因作物的安全利用提供理論參考。