普通小麥鎘吸收基因Cdu1組成的功能標記檢測

張樂 陳為序 董慧 陳桂玲 余利 李興鋒

摘要：利用新開發(fā)的功能型共顯性分子標記usw47對86份供試普通小麥品種(系)的鎘吸收基因Cdu1組成進行了檢測和分析，結(jié)果表明：59個材料具有低鎘吸收型對應(yīng)的375bp特異帶，占68.60％；27個材料具有高鎘吸收型對應(yīng)的225bp特異帶，占31.40％。在47份小偃6號的衍生材料中，有74.47％的衍生品種(系)在鎘吸收基因Cdu1基因位點上與小偃6號一致，具有低鎘吸收型的優(yōu)良等位變異；25.53％的衍生后代具有高鎘吸收型的等位變異類型。山東省近年選育的小麥材料中多數(shù)具有低鎘吸收型的特異條帶。

關(guān)鍵詞：小麥；鎘吸收基因；Cdu1；功能型分子標記

中圖分類號：Q754文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0006-05

鎘(Cd)是一種有毒金屬，以微量形式自然存在于幾乎所有的土壤中，被認為是最重要的重金屬環(huán)境污染物之一。農(nóng)業(yè)、采礦業(yè)以及工業(yè)生產(chǎn)活動使大量的鎘進入環(huán)境中，并隨著污泥農(nóng)用及污灌等進入農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，造成土壤鎘污染日趨嚴重。當鎘在土壤環(huán)境中含量達到或超過傷害閾值時，就會抑制作物根系生長，降低其光合作用和葉綠素含量，破壞作物體內(nèi)保護酶系統(tǒng)，干擾碳、氮代謝及水分和養(yǎng)分吸收，使質(zhì)膜透性加大等，表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀，如植株矮小、葉片褪綠、生長遲緩等，嚴重影響作物產(chǎn)量。更為嚴重的是，鎘能夠在作物體內(nèi)，特別是籽粒中大量積累，并通過食物鏈傳遞和富集，從而危害人體健康，日本的骨痛病就是鎘污染大米所致。含鎘食物，尤其含鎘谷物和蔬菜是人體內(nèi)鎘的主要來源。因此，如何降低鎘在農(nóng)作物中的富集受到廣泛關(guān)注。目前，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)的食品法規(guī)委員會已設(shè)定了小麥中鎘含量的標準值，為0.2mg/kg(CODEX STAN193-1995，2009)。

部分硬質(zhì)小麥品種具有富集鎘元素使谷物中鎘水平超過上述標準值的基因潛力，該性狀由主效基因控制，該基因被定名為Cdu1，并被定位于5B染色體的長臂上。了解小麥品種Cd吸收的遺傳基礎(chǔ)及其基因組成，可以為選育低鎘吸收型品種提供理論依據(jù)。分子標記輔助選擇在育種中的應(yīng)用越來越受到重視。ScOpc20是一個SCAR標記，已經(jīng)被成功用于培育低鎘吸收型的小麥新品種，但由于它是一個與高鎘含量相關(guān)的顯性標記，因此限制了該標記在回交育種中的應(yīng)用。Wiebe等(2010)開發(fā)了一個與作物鎘吸收性狀基因變異共分離的EST衍生標記(XBF474090)，該標記已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)化為一個共顯性CAPS標記，并被定名為usw47。在用限制性內(nèi)切酶Hpyl88 I對PCR擴增產(chǎn)物進行消化之后，經(jīng)電泳分析，該標記可用于檢測鎘吸收性狀基因的兩個等位基因，并成功將96個小麥品系分成低鎘吸收型或高鎘吸收型。因此，usw47在低鎘吸收型小麥新品種的選育中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本試驗利用鎘吸收基因Cdu1的功能型分子標記usw47對86份小麥材料進行檢測，旨在明確這些材料中鎘吸收等位基因的基因組成，同時分析探討了其中的小偃6號及其衍生系的鎘吸收基因的等位變異，以期為培育低鎘小麥品種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1試驗材料

所用材料共86份，見表1。其中1～52號包括小偃6號、其親本小偃96和鄭引4號、兩個姊妹系品種小偃4號和小偃5號及小偃6號的衍生材料，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所李振聲課題組提供；中國春、J-11、IKE、Wx1D、江蘇白火麥、Chancellor、銘賢169為遺傳材料；60～86號材料為山東省近年育成品種，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。所有材料在2009～2010年國家小麥改良分中心泰安試驗基地統(tǒng)一種植，田間常規(guī)管理。

1.2DNA的提取

每個品種選取幼嫩葉片5～6cm，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末，放入2ml離心管中，采用SDS一酚法提取小麥基因組DNA，并用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量，用于鎘吸收基因Cdu1位點的分子檢測。

1.3特異性標記

鎘吸收基因相關(guān)標記usw47序列參考網(wǎng)站http：//maswheat.ucdavis.edu/protocols/Cadmium/index.htm，所用特異性引物由上海生工公司合成，分別為usw47-F：5'-GCTAGGACTTGAT-TCATTGAT-3'，usw47-R：5'-AGTGATCTA-AACGTTCTTATA-3'。

1.4PCR擴增及酶消化

PCR反應(yīng)體系均為20μl，含10×PCR buffer2.5μl，2mmol/L MgCl₂2μl，200mmol/L dNTPs1.5μl，每個引物1μl(約10ng)，基因組DNA 3μl(30～100ng)，TaqDNA聚合酶1U，其余由ddH₂0補齊。PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸60s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

PCR擴增產(chǎn)物首先經(jīng)Hpy 188I限制性內(nèi)切酶消化，酶消化反應(yīng)體系均為15μl，含PCR產(chǎn)物4μl，NEB Hpyl88I 0.25μl，NEB buffer4 1.5μl，ddH₂0 9.25μl。酶消化程序為：37℃反應(yīng)1h；65℃酶變性20min；最后維持在10％。

消化產(chǎn)物采用6％～8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測，1×TE緩沖溶液，凝膠經(jīng)硝酸銀染色，顯影后采用天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描成像。

2.結(jié)果與分析

usw47為共顯性標記，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hpy l88 I消化后，電泳結(jié)果顯示出兩條差異帶，大小分別為375bp和225bp，分別對應(yīng)低鎘吸收型等位基因和高鎘吸收型等位基因。此標記清晰易讀，重復(fù)性好，可用于檢測鎘吸收基因Cdu1位點上等位基因相應(yīng)的類型。

本試驗所用86份小麥材料中，59份材料擴增出375bp的特異性條帶，為低鎘吸收型，占68.60％；27份材料擴增出225bp的特異性條帶，為高鎘吸收型，占31.40％(表1)。

小偃6號及其親本小偃96和鄭引4號、姊妹系小偃4號和小偃5號均擴增出375bp的特異性條帶，均為低鎘吸收型。47份小偃6號的衍生材料中，有35份材料擴增出375bp的特異性條帶，占74.47％；有12份擴增出225bp的特異性條帶，分別是白春5號、晉麥41、晉麥60、魯麥14、陜213、陜253、西農(nóng)2258、小偃15、鄭麥9023、鄭麥9405、鄭農(nóng)16、鄭優(yōu)7號，占25，53％(表1)。部分小偃6號衍生材料的多態(tài)性檢測結(jié)果見圖1。

遺傳材料中國春、Chancellor、J-11、IKE、江蘇白火麥和銘賢169及山東省重要的小麥品種如

濟麥19、濟南17、山農(nóng)15、臨麥2號、臨麥4號、濰麥8號、煙農(nóng)19等擴增出225bp的特異帶，為高鎘吸收材料；而濟麥20、濟麥21、濟麥22和多數(shù)山農(nóng)系列品種為低鎘吸收類型(表1)。部分遺傳材料及山東省育成品種的多態(tài)性檢測結(jié)果見圖2。

3.討論與結(jié)論

鎘是一種重要的環(huán)境和工業(yè)毒物，也是一種半衰期很長(長達10～35年)的多器官、多系統(tǒng)毒物，隨著人類生活生產(chǎn)活動，逐漸在土壤中及作物體內(nèi)積累，不僅對農(nóng)作物的生長發(fā)育、光合特性、產(chǎn)量、品質(zhì)等理化性狀產(chǎn)生影響，而且可經(jīng)食物鏈進入人體，嚴重影響人類健康。植物硫代謝、抗氧化系統(tǒng)和Cd²⁺跨膜運輸是植物對重金屬鎘響應(yīng)的主要途徑。但，李妍發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶未對鎘脅迫條件下的小麥幼苗起到明顯的保護作用。因此，分析作物的鎘耐受差異、緩解鎘對農(nóng)作物的毒害、培育低鎘吸收型作物品種成為研究的焦點。小麥是我國北方地區(qū)的主要糧食作物之一，了解現(xiàn)有小麥品種鎘吸收的遺傳基礎(chǔ)及其基因組成，對培育低鎘吸收型小麥品種意義重大。

本研究利用鎘吸收基因的功能型分子標記usw47對86份小麥品種(系)進行分子檢測，結(jié)果表明，大多數(shù)材料(68.60％)具有低鎘吸收型所對應(yīng)的等位變異。其中，小偃6號及其親本小偃96和鄭引4號、姊妹系小偃4號和小偃5號、35個衍生材料均為低鎘吸收型，說明骨干親本小偃6號具有低鎘吸收型的優(yōu)良基因潛力，而其大多數(shù)衍生材料能很好地保存低鎘吸收型的優(yōu)良基因等位變異。遺傳材料除WxlD為低鎘吸收類型外，中國春、J-11、IKE、江蘇白火麥、Chancellor和銘賢169均為高鎘吸收型，不宜用于低鎘吸收型小麥新品種的選育。

在27個山東省育成的小麥品種中，18個為低鎘吸收型，占66.67％；9個為高鎘吸收型，占33.33％。一些育成年限稍長的品種，如魯麥14、濟南17，多為高鎘吸收型；而大多數(shù)新育成的品種，如良星99、山農(nóng)14、山農(nóng)16、煙農(nóng)23、煙農(nóng)24、煙農(nóng)25、濟麥20和濟麥21等，均為低鎘吸收型品種，說明這部分品種可以用作選育低鎘小麥的親本。值得注意的是山農(nóng)14和山農(nóng)15雖都是濟南17(高鎘吸收型)的后代，但一個為低鎘吸收型，一個為高鎘吸收型，這可能是由雜交組合的另一個親本不同造成的。

本研究僅是利用功能標記usw47對普通小麥的鎘吸收基因類型進行初步鑒定，對于鑒定出的低鎘吸收型小麥品種，還需通過土培和水培相結(jié)合的方法進一步驗證。隨著小麥基因組學(xué)研究的進展和研究技術(shù)的提高，將會有更多的功能標記被開發(fā)出來并用于準確檢測相關(guān)基因位點的等位變異。

參考文獻：

[1]顧繼光，林秋奇，胡韌，等.土壤一植物系統(tǒng)中重金屬污染的治理途徑及其研究展望[J].土壤通報，2005，36(1)：128-133.

[2]趙其國，周炳中，楊浩，等.江蘇省環(huán)境質(zhì)量與農(nóng)業(yè)安全問題研究[J].土壤，2002，34(1)：1-8.

[3]Das P，samantaray S，Rout G R Studies on cadmium toxicityin pjans：a review[J].Environmental Pollution，1997，98：29-36.

[4]何俊瑜，任艷芳，朱誠，等.鎘脅迫對鎘敏感水稻突變體活性氧代謝及抗氧化酶活性的影響[J].生態(tài)環(huán)境，2008，17(3)：1004-1008.