大白菜游離小孢子培養(yǎng)和植株再生技術(shù)研究進(jìn)展

董彥琪 肖艷 段風(fēng)華 原讓花 原連莊 吳濤 霍學(xué)文

摘要：綜述了影響小孢子培養(yǎng)的主要因素，包括供試材料(基因型、外部環(huán)境及生理狀況)、小孢子(發(fā)育時(shí)期和接種濃度)、培養(yǎng)基成分(基本培養(yǎng)基、蔗糖、生長調(diào)節(jié)劑和活性炭)、培養(yǎng)方式(低溫預(yù)處理、高溫預(yù)處理、振蕩培養(yǎng))等；闡述了影響小孢子植株再生的一些因素——胚狀體發(fā)育階段、小孢子胚在液體培養(yǎng)基中滯留時(shí)間、培養(yǎng)基水分含量、活性炭等；總結(jié)了小孢子植株繼代與加代技術(shù)，并提出了在該領(lǐng)域存在和需要解決的問題，展望了其在研究和生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：大白菜；游離小孢子培養(yǎng)；胚狀體；培養(yǎng)基；植株再生；生長調(diào)節(jié)劑；活性炭

大白菜 [Brassica campestris ssp.pekinensis(Lour.)Olsson]是原產(chǎn)于我國的一種重要蔬菜作物，屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種。大白菜在我國秋、冬季蔬菜生產(chǎn)與供應(yīng)中居主導(dǎo)地位，是我國栽培面積最大、產(chǎn)量最高的蔬菜作物。大白菜為異花授粉植物，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，目前雜交種親本系的選育主要采用常規(guī)自交方法，此法所需年限較長，要育成純合的可利用親本需要5～7年。近年來常規(guī)育種的不足在實(shí)際工作中日漸明顯，各國學(xué)者開始尋找育種的新途徑和新方法。游離小孢子培養(yǎng)(isolatedmicrospore culture，IMC)技術(shù)是一種新興的生物技術(shù)。它具有單細(xì)胞、單倍體和較高胚胎發(fā)生率及較高同步性等特點(diǎn)，通過這種途徑可以迅速獲得雙單倍體(doubled haploid，DH)純合植株，2-3年內(nèi)便可獲得基因型完全純合的自交系，這就大大加快了育種進(jìn)程。20世紀(jì)80年代末期，日本學(xué)者Sato等首次在大白菜春性早熟類型上培養(yǎng)得到小孢子胚和再生植株：90年代初期，我國學(xué)者率先在國內(nèi)開展了大白菜小孢子培養(yǎng)。此后，國內(nèi)外學(xué)者在小孢子胚影響因素和發(fā)生機(jī)制、小孢子植株再生和加倍機(jī)制及實(shí)踐應(yīng)用等方面做了大量的探索，并取得了許多重要研究進(jìn)展，有必要進(jìn)行綜述和探討。

1影響游離小孢子胚胎發(fā)生的因素

1.1供試材料對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

1.1.1基因型基因型是影響小孢子胚胎發(fā)生率的關(guān)鍵性因素?；蛐蛯?duì)白菜小孢子胚胎發(fā)生能力的決定作用體現(xiàn)在2個(gè)方面：(1)基因型的反應(yīng)范圍。曹鳴慶等、栗根義等、蔣武生等等眾多學(xué)者認(rèn)為大白菜是具有較強(qiáng)游離小孢子胚胎發(fā)生能力的栽培植物種，能成胚的基因型分別為94.12％、92.31％和87.50％：徐艷輝等的試驗(yàn)結(jié)果相反，據(jù)其報(bào)道能成胚的基因型比率較低，為18.92％。(2)胚胎發(fā)生頻率(產(chǎn)胚率)的差異。曹鳴慶等、栗根義等、蔣武生等、徐艷輝等、張鳳蘭等、方淑桂等、周英等、耿建峰等、胡齊贊等、張亞麗等、付文婷等認(rèn)為不同基因型大白菜胚狀體發(fā)生能力有明顯差異：四倍體大白菜基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)生能力有顯著影響。研究表明小孢子胚胎發(fā)生能力同其他遺傳性狀一樣。是一種受基因調(diào)控的遺傳特性，基因型是影響小孢子胚胎發(fā)生啟動(dòng)與否的內(nèi)在因素。

小孢子胚胎的發(fā)生能力還與植株類型有一定的相關(guān)性。劉凡等報(bào)道疊抱類型大白菜產(chǎn)胚率高于合抱類型，早熟類型產(chǎn)胚率高于中、晚熟類型；方淑桂等㈣報(bào)道擰抱炮彈型品種不但比疊抱型品種胚誘導(dǎo)率高，且胚產(chǎn)量也高。

1.1.2生長環(huán)境供體植株生長的溫度條件是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因子。一般從發(fā)育健壯的植株上取花蕾進(jìn)行培養(yǎng)效果較好?，F(xiàn)蕾開花期植株處于晝夜溫度10～25℃條件下胚狀體產(chǎn)量較高。日照長度對(duì)小孢子產(chǎn)胚量也有一定影響，長日照(14-18h)和低溫(15～20℃)條件下植株胚狀體發(fā)生數(shù)量及植株再生率高。方淑桂等研究表明，供體植株采蕾期的氣溫條件是小孢子胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素，采蕾前3d氣溫在14℃/24℃(夜/晝)最適宜小孢子發(fā)育。因此，在無人工氣候室的情況下，小孢子培養(yǎng)工作盡量在春季(3-4月份)進(jìn)行，以避開秋季日照短、溫度高對(duì)小孢子培養(yǎng)不利的環(huán)境條件。

1.1.3 生理狀況供體植株的花序齡對(duì)胚胎發(fā)生的影響不同。申書興等研究表明。無論是二倍體品種還是四倍體品種，株齡對(duì)小孢子胚胎發(fā)生率影響顯著，盛花期是小孢子培養(yǎng)的適宜時(shí)期。方淑桂等研究表明，盛花期的花蕾和供體植株?duì)I養(yǎng)狀況良好，有利于胚胎發(fā)生及植株再生。軒正英等研究表明，株齡對(duì)胚誘導(dǎo)率有一定影響。盛花期和末花期產(chǎn)胚率最高。周英等研究表明盛花期出胚率高于初花期和末花期，張亞麗、王秀英等也得到了同樣結(jié)果，王秀英等還進(jìn)一步指出下午取蕾優(yōu)于上午。

1.2小孢子發(fā)育時(shí)期及密度對(duì)胚狀體形成的影響

1.2.1發(fā)育時(shí)期選擇合適的花粉發(fā)育時(shí)期是提高誘導(dǎo)頻率的重要因素。胚胎發(fā)生的激發(fā)啟動(dòng)，大致發(fā)生在單核中期至單核靠邊期這一短暫的發(fā)育過程中。與二倍體植株相似，四倍體大白菜的小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)胚胎發(fā)生率也有顯著影響。單核靠邊期小孢子占多數(shù)時(shí)胚胎產(chǎn)量最高。所以，選取合適的花粉發(fā)育時(shí)期對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)非常重要。曹鳴慶等研究發(fā)現(xiàn)。蕾長與小孢子發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)。CCll基因型大白菜花蕾長2.0-2.5mm時(shí)，處于單核中期的小孢子占41.7％，處于單核靠邊期的小孢子占58.3％，此時(shí)產(chǎn)胚量最高。鄒金美通過細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花蕾長2.0～3.0mm，花瓣與花藥長度比為1/2～4/5時(shí)，50％-70％的小孢子處于單核靠邊期，最適合進(jìn)行花藥和游離小孢子培養(yǎng)?；ɡ俅笮∵€與栽培條件有關(guān)，如溫室栽培的F₁，代材料，花蕾大小6～7mm時(shí)小孢子仍處于單核晚期，但生長在大田的植株合適花蕾僅2-4mm。因此，細(xì)胞學(xué)觀察與植物學(xué)結(jié)合確定合適的取材是必要和切實(shí)可行的。

1.2.2接種濃度接種濃度是小孢子培養(yǎng)能否成功的一個(gè)至關(guān)重要的因素。過高和過低均不利于胚的發(fā)育。過高時(shí)，會(huì)消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，并且釋放許多有害物質(zhì)，影響胚的發(fā)育；小孢子發(fā)育需要群體效應(yīng)，過低同樣不利于小孢子胚胎的生長發(fā)育。一般認(rèn)為小孢子密度2×10⁴～4×10²個(gè)·mL^-1最合適，而最近的研究表明1×10⁵～2×10⁵個(gè)·mL^-1最為合適。

1.3培養(yǎng)基成分對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

1.3.1基本培養(yǎng)基培養(yǎng)基是誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)，其不僅影響小孢子細(xì)胞的分裂，而且對(duì)胚狀體產(chǎn)生再生植株的過程也有深刻影響。栗根義等曾用改良的Lichter培養(yǎng)液。日本學(xué)者Sato等采用了大量元素減半的NLN(Nitsch and Nitsch)培養(yǎng)基，張鳳蘭等采用了BM培養(yǎng)基。近年來，絕大多數(shù)學(xué)者采用最適宜的NLN基本培養(yǎng)基，大大提高了培養(yǎng)效果。大白菜四倍體材料的小孢子培養(yǎng)也采用了NLN基本培養(yǎng)基。

1.3.2蔗糖小孢子培養(yǎng)過程中普遍采用蔗糖作為碳源，其不但提供能量還維持細(xì)胞的滲透壓。蔣武生等在不加任何激素的試驗(yàn)中比較了不同蔗糖濃

度的NLN培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，結(jié)果表明蔗糖含量為13％時(shí)培養(yǎng)效果較好。也有人選擇10％和17％蔗糖濃度，高濃度蔗糖可保持小孢子活力，而低濃度蔗糖能促進(jìn)小孢子分裂及其進(jìn)一步發(fā)育。

1.3.3外源激素外源激素對(duì)胚形成和植株再生的影響至今沒有取得一致的結(jié)果。軒正英等研究表明，6-BA(6-Benzylaminopurine，6-芐基嘌呤)能明顯促進(jìn)胚狀體的發(fā)生，質(zhì)量濃度0.05mg·L^-1時(shí)胚產(chǎn)量最高；張亞麗等和付文婷等研究認(rèn)為6-BA對(duì)胚狀體的發(fā)生和發(fā)育有促進(jìn)作用，適宜質(zhì)量濃度為0.2mg·L^-1；韓陽等研究認(rèn)為6-BA的最適宜質(zhì)量濃度為0.4mg·L^-1。

徐艷輝等報(bào)道，BA(Benzylaminopurine，芐氨基腺嘌呤)對(duì)小孢子胚胎發(fā)生有一定的促進(jìn)作用，最佳質(zhì)量濃度為0.2mg·L^-1；但對(duì)難成胚的基因型作用不大。韓陽等研究認(rèn)為，NAA(1-naphthlcetic acid，α-萘乙酸)質(zhì)量濃度在0.10-1.00mg·L^-1時(shí)對(duì)大白菜小孢子胚的發(fā)生有抑制作用，且濃度越高，其抑制作用越大。另外，在四倍體大白菜小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，BA在0.2mg·L^-1水平下，NAA為0～1.0mg·L^-1時(shí)小孢子胚都有較高的發(fā)生頻率，但NAA高于2.0mg·L^-1時(shí)會(huì)出現(xiàn)抑制作用。在0.5mg·L^-1NAA水平下，BA為0.05～0.20mg·L^-1時(shí)小孢子產(chǎn)胚率高；BA超過0.40mg·L^-1時(shí)出現(xiàn)抑制作用。

蔣武生等[司研究表明0.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA對(duì)小孢子胚胎發(fā)生具有抑制作用。韓陽等研究認(rèn)為較低濃度的細(xì)胞分裂素能促進(jìn)胚狀體的發(fā)生，6-BA的作用大于ZT(zeatin，玉米素)，ZT的最適宜質(zhì)量濃度為0.2Mg·L^-1；2,4-D(2,4-D butyl ester，2，4-D丁酯)對(duì)小孢子胚的形成有強(qiáng)烈的抑制作用。

1.3.4活性炭適量的活性炭可以加快離體培養(yǎng)進(jìn)程，提高小孢子胚產(chǎn)量、子葉形胚率及胚狀體發(fā)育的同步性，但活性炭濃度不盡一致。徐艷輝等同報(bào)道，0.01-0.02mg·mL^-1的活性炭可明顯促進(jìn)小孢子胚狀體形成。申書興等研究發(fā)現(xiàn)添加0.05-0.10mg·L^-1的活性炭對(duì)二倍體及四倍體大白菜小孢子胚生率和發(fā)育同步性均有明顯促進(jìn)作用。孫丹等研究表明。在培養(yǎng)基中添加0.10mg·mL^-1活性炭能增加大多數(shù)品種的胚產(chǎn)量。原因可能是適量活性炭吸附了小孢子胚所產(chǎn)生的有害物質(zhì)。蔣武生等研究表明，0.50g·L^-1的活性炭有利于小孢子胚誘導(dǎo)和形成。劉凡等研究也發(fā)現(xiàn)，1.40mg·mL^-1活性炭質(zhì)量濃度下。原來一些無胚狀體形成的材料有胚形成。僅有較少胚狀體形成的材料產(chǎn)生了較多胚狀體；但個(gè)別材料無論如何也得不到胚或者只能得到1至數(shù)個(gè)不正常的胚。韓陽等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的活性炭對(duì)小孢子胚發(fā)生表現(xiàn)出抑制作用。

1.4培養(yǎng)方法對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

1.4.1低溫(冷擊)預(yù)處理培養(yǎng)前的花蕾低溫預(yù)處理對(duì)小孢子胚胎發(fā)生有一定影響。Sato等報(bào)道冷擊預(yù)處理花蕾能提高大白菜小孢子胚發(fā)生率。軒正英等研究表明，花序在4℃下處理1-2d時(shí)，小孢子誘導(dǎo)率可明顯提高。路翠玲等研究也得到了同樣結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)未經(jīng)低溫處理或處理時(shí)間過長，其胚狀體誘導(dǎo)率較低。耿建峰等研究表明低溫處理0-5d范圍內(nèi)小孢子胚誘導(dǎo)率差異不大，超過5d則明顯降低。

1.4.2高溫(熱激)預(yù)處理

當(dāng)大白菜小孢子接種到培養(yǎng)基上時(shí)，需要高溫來啟動(dòng)和誘導(dǎo)改變小孢子發(fā)育的定向過程。即從配子體發(fā)育過程轉(zhuǎn)變?yōu)殒咦芋w發(fā)育過程。栗根義等認(rèn)為35℃高溫預(yù)處理對(duì)大白菜游離小孢子胚狀體誘導(dǎo)很重要，其作用機(jī)制可能是改變小孢子發(fā)育途徑，阻止小孢子向成熟花粉粒方向發(fā)展，促進(jìn)其沿胚胎發(fā)育途徑發(fā)展，最后形成小孢子胚。

姜立榮等研究認(rèn)為，35℃高溫誘導(dǎo)下小孢子第1次細(xì)胞分裂方式多種多樣，但對(duì)稱分裂方式占優(yōu)勢(shì)。劉公社等應(yīng)用FDA和DAPI熒光顯微技術(shù)，觀察了高溫處理對(duì)小孢子培養(yǎng)的影響，研究表明，33℃高溫預(yù)處理24h，然后轉(zhuǎn)入25℃條件下培養(yǎng)。小孢子成活率雖在第1天急劇下降，但隨后仍保持一定水平：膨脹后的小孢子多呈圓球形，以類似于胚胎細(xì)胞的對(duì)稱分裂方式為主：小孢子經(jīng)多次分裂形成緊密多細(xì)胞團(tuán)，最終形成胚狀體。李菲等研究表明小孢子主要發(fā)育途徑為B途徑，33℃高溫預(yù)處理24h后單倍體小孢子體積膨大，染色體發(fā)生自然加倍，從而激發(fā)小孢子進(jìn)入孢子體發(fā)育途徑。

趙冰等研究表明33℃高溫預(yù)處理24h，不同基因型材料出胚量存在明顯差別，誘導(dǎo)效率越高的基因型對(duì)高溫反應(yīng)越敏感，出胚量也越多。蔣武生等研究發(fā)現(xiàn)，較易誘導(dǎo)的基因33℃高溫處理24h的效果最好，對(duì)于難誘導(dǎo)的基因型處理48h后胚誘導(dǎo)率高。劉公社等咖研究認(rèn)為小孢子培養(yǎng)的高溫預(yù)處理時(shí)間因基因型而異，一般在24-48h有效：若以分裂頻率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。小孢子接受高溫處理的敏感期位于開始培養(yǎng)的12h內(nèi)：若以胚胎發(fā)生為評(píng)價(jià)指標(biāo)，敏感期位于開始培養(yǎng)的24h內(nèi)。

1.4.3振蕩培養(yǎng)游離小孢子培養(yǎng)靠固體和液體培養(yǎng)2種方式。一般液體培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)容易被小孢子吸收，但由于透氣不良，會(huì)有褐色胚產(chǎn)生。申書興等在小孢子培養(yǎng)14d后進(jìn)行搖床培養(yǎng)(60r·min^-1震蕩培養(yǎng))7d，結(jié)果表明，搖床培養(yǎng)改善了培養(yǎng)基通氣性，促進(jìn)了原胚迅速發(fā)育成子葉形胚，促進(jìn)子葉形胚率和胚狀體發(fā)育的同步性及小孢子胚直接成苗。趙俊等報(bào)道80r·min^-1低頻振蕩極大地提高了出胚數(shù)量。

2影響小孢子胚植株再生的因素

2.1胚狀體發(fā)育階段

在早期的研究中小孢子植株成苗率很低。只有5％-10％。小孢子胚再生受基因型影響，再生能力強(qiáng)的基因型易形成小孢子植株，但同一基因型處于不同發(fā)育階段的小孢子胚成苗率差異很大，子葉期胚具有迅速再生成苗的能力。魚雷期胚則較難成苗，處于球形期和心形期的胚則發(fā)育停滯。曹鳴慶等研究表明心形期至魚雷期的胚胎移植后半數(shù)以上發(fā)育為幼苗，其中5％～10％為白化苗。韓陽等研究發(fā)現(xiàn)成熟的子葉形胚成苗率可達(dá)20％，子葉已擴(kuò)大的萌發(fā)胚成苗率更高，在90％以上；發(fā)育早期的胚較難成苗，尤其是心形胚和球形胚成苗率均為0。

2.2小孢子胚在液體培養(yǎng)基中滯留時(shí)間長短

成熟的小孢子胚在培養(yǎng)基中滯留時(shí)間長短對(duì)植

株再生影響甚大。劉凡等研究表明停留14d和21d的小孢子胚轉(zhuǎn)移至MS₀培養(yǎng)56d時(shí)成苗率分別達(dá)到85％和81.6％。停留28d和35d時(shí)最終成苗率只有63.3％和42.7％，大大低于前兩者。

2.3固體培養(yǎng)基中水分含量

增加瓊脂含量降低培養(yǎng)基中的含水量，可提高胚狀體再生植株率。韓陽等研究表明。小孢子胚成熟后需要較干燥的生長環(huán)境，及時(shí)將成熟的子葉期胚轉(zhuǎn)入相對(duì)干燥的培養(yǎng)環(huán)境對(duì)植株再生有利。當(dāng)培養(yǎng)基中瓊脂含量是1.2％時(shí)，最有利于小孢子胚成苗，再生株率為50.5％。劉凡等以含瓊脂1.2％的MS₀培養(yǎng)基處理的死胚數(shù)量最少，植株成苗率最高，達(dá)到85.8％。申書興等在四倍體材料小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基水分狀況與成苗率有關(guān)，適宜胚狀體成苗的培養(yǎng)基是B5附加3％蔗糖和1.2％瓊脂。蔣武生等報(bào)道，B5+0.2mg·L^-16-BA+3％蔗糖+1％瓊脂有利于小孢子胚長成植株。

2.4活性炭

劉凡等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)活性炭處理獲得的胚狀體在光照下轉(zhuǎn)綠、萌發(fā)、成苗等方面。都不及未經(jīng)活性炭處理獲得的小孢子胚。原因可能在于活性炭的吸附作用無選擇性，當(dāng)超過適宜濃度后，在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時(shí)，也吸附了生長調(diào)節(jié)劑、鐵鹽、維生素等與胚生長和分化密切相關(guān)的必要物質(zhì)。因此活性炭濃度不宜太高，否則會(huì)起負(fù)作用。韓陽等研究表明，添加活性炭比不含活性炭成苗率高20％～122.5％，其中200mg·L^-1活性炭最有利于小孢子胚的成苗。

3小孢子胚繼代、生根和移栽

蔣武生等研究表明，小孢子胚可在B5+0.20mg·L^-16-BA+0.02mg·L^-1NAA繼代培養(yǎng)基上每25～30d繼代1次。再將高度為3-5cm的健壯苗轉(zhuǎn)移到Ms+0.10mg·L^-1NAA生根培養(yǎng)基上形成完整植株，植株4～5片葉時(shí)。移入盛有園田土的營養(yǎng)缽中7d后生根，10～15d后成活，成活率可達(dá)95％。付文婷等也有近似報(bào)道，B5+0.20mg·L^-16-BA+0.02mg·L^-1NAA有利于小孢子胚發(fā)育成植株，1/2MS+0.1mg·L^-1NAA適宜小孢子植株生根。徐艷輝等研究表明，2個(gè)基因型的小孢子胚在MS+0.8％瓊脂+3％蔗糖+0.1mg·L^-1KT(Kinetin，激動(dòng)素)+0.5mg·L^-1BA上的成活率分別為82％和92.5％。繼代培養(yǎng)后的小孢子植株在1/2MS+3％蔗糖+0.8％瓊脂+0.1mg·L^-1NAA生根培養(yǎng)基上生根良好，已生根的小孢子植株移到1/2壤土+1/2糞土的盆中便可生長。張亞麗等研究表明，B5+0.1mg·L^-1GA³(GibberellinA₃，赤霉素)是小孢子胚芽分化的最佳培養(yǎng)基，1/2MS+0.1mg·L^-1NAA為小孢子植株最適宜生根培養(yǎng)基。周英等研究表明，MS+0.10mg·L^-1NAA為小孢子植株生根最適宜培養(yǎng)基，

趙岫云等研究表明，小孢子植株再生能力的遺傳符合加性一顯性模式。主要受核基因控制，基因作用以加性效應(yīng)為主。植株再生能力由隱性基因控制，狹義遺傳力為70.6％。這為改良小孢子植株再生能力差的材料提供了一條有意義的途徑，可選用植株再生能力強(qiáng)的材料與之雜交，提高后代植株再生能力，從而獲得更多的小孢子再生植株。

4小孢子植株加倍技術(shù)

由小孢子培養(yǎng)所得到的植株只有通過染色體加倍成為二倍體才能應(yīng)用于育種實(shí)踐。小孢子再生植株中出現(xiàn)DH植株的頻率不完全相同，但總體趨勢(shì)是頻率較高。曹鳴慶等研究由小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的小孢子植株中自然加倍率在50％～70％。張鳳蘭等研究了春秋兩季小孢子再生植株自然加倍率不等，多數(shù)品種在70％，還認(rèn)為由該游離小孢子培養(yǎng)得到的再生植株無需人工加倍處理，有自然加倍成為二倍體的特點(diǎn)。這一研究結(jié)果為該技術(shù)在育種工作上的有效利用提供了廣闊前景。李菲等研究表明，小孢子胚再生植株具有較高的自然加倍率，并且與熱激誘導(dǎo)激發(fā)小孢子單核自然加倍為二倍體密切相關(guān)。如需人工加倍，主要用0.2～4.0mg·g^-1秋水仙堿處理單倍體植株。

5問題與展望

綜上所述，游離小孢子培養(yǎng)這一具有重要理論意義和實(shí)踐價(jià)值的生物技術(shù)越來越被科研工作者所重視，并得到廣泛應(yīng)用。但還存在著許多理論和實(shí)際問題，如在適宜條件下，大多數(shù)基因型可獲得小孢子胚，但也有少數(shù)基因型不能獲得小孢子胚及再生植株，這一領(lǐng)域所取得的進(jìn)展尚未達(dá)到隨意操作雄配子的程度，在啟動(dòng)機(jī)理、微觀發(fā)育機(jī)制、發(fā)育途徑以及與之相關(guān)的生理生化方面的理論研究還十分欠缺。

利用該技術(shù)能夠在較寬的基因型范圍內(nèi)以較高的胚狀體發(fā)生率獲得小孢子胚和再生植株，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到建立起完善的、高頻的再生體系的程度。小孢子植株具有自然加倍成為二倍體的特點(diǎn)，在遺傳和g種研究方面具有十分誘人的應(yīng)用前景，但關(guān)于小孢子胚自然加倍機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

今后應(yīng)加強(qiáng)理論研究和實(shí)驗(yàn)技術(shù)兩方面的工作，建立能穩(wěn)定、高效地獲得純合二倍體的游離小孢子培養(yǎng)體系，使之與傳統(tǒng)育種技術(shù)有機(jī)結(jié)合成為大白菜育種的一個(gè)重要組成部分。

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