醋酸丙氨瑞林對(duì)人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤的作用及其對(duì)TRF1表達(dá)的影響〔1〕

李紅梅，張三元，趙文英，范靜靜

(1.山西省婦幼保健院，山西 太原 030012；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西 太原 030001；3.山西省人民醫(yī)院，山西太原 030012)

醋酸丙氨瑞林對(duì)人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤的作用及其對(duì)TRF1表達(dá)的影響〔1〕

李紅梅1，張三元2，趙文英1，范靜靜3

(1.山西省婦幼保健院，山西 太原 030012；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西 太原 030001；3.山西省人民醫(yī)院，山西太原 030012)

目的：探討不同劑量的醋酸丙氨瑞林對(duì)人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響及TRF1的表達(dá)情況。方法：采用HEC-1-B細(xì)胞成功建立人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，選取34 只雌性荷瘤裸鼠隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、低劑量醋酸丙氨瑞林組(20 μg/kg)、中劑量醋酸丙氨瑞林組(40 μg/kg)、高劑量醋酸丙氨瑞林組(80 μg/kg)。觀察裸鼠生長發(fā)育情況，每7天測(cè)量皮下移植瘤體積，4 周后處死裸鼠，取出移植瘤，測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算抑瘤率。移植瘤組織石蠟包埋行蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡下觀察瘤細(xì)胞形態(tài)變化。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組瘤組織中端粒重復(fù)因子1(TRF1)的表達(dá)情況。結(jié)果：低、中、高醋酸亮丙瑞林組的抑瘤率逐漸增高，分別為15.03%、21.80%及39.98%，各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HE染色后干預(yù)組瘤細(xì)胞排列較對(duì)照組稀疏，瘤細(xì)胞核深染、固縮。隨著藥物劑量增加，免疫組織化學(xué)檢測(cè)到瘤組織中TRF1表達(dá)下調(diào)，各干預(yù)組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：醋酸丙氨瑞林對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-B裸鼠皮下移植瘤生長有抑制作用，可能與TRF1蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

子宮內(nèi)膜癌；丙氨瑞林；裸鼠移植瘤；端粒重復(fù)因子1(TRF1)

子宮內(nèi)膜癌(EC)是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，多數(shù)為腺癌，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確，趨于年輕化。復(fù)發(fā)、晚期以及有嚴(yán)重合并癥的患者，常常需要輔助以藥物治療(化學(xué)藥物、激素)和放療[1]。其中，激素治療因其安全性高的特點(diǎn)受到研究者的青睞，其中促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa)的應(yīng)用備受關(guān)注。GnRHa在一些激素依賴性的腫瘤中已進(jìn)入到臨床應(yīng)用階段，如乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌[2]。本實(shí)驗(yàn)通過建立動(dòng)物模型，觀察不同劑量的丙氨瑞林對(duì)腫瘤生長及對(duì)TRF1表達(dá)的影響，推斷促性腺激素釋放激素(GnRH)可能的抑癌機(jī)制，為GnRHa在臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

〔1〕本課題為山西省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2013011045)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性裸鼠34 只，4～6 周齡，購自中國藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)中心，無菌條件下飼養(yǎng)；子宮內(nèi)膜癌HEB-1B細(xì)胞株(細(xì)胞株表面含有ER、PR、GnRH-R)；丙氨瑞林購自馬鞍山豐源制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HEC-1-B細(xì)胞培養(yǎng)

將對(duì)數(shù)期的HEC-1-B細(xì)胞株置于高糖培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合時(shí)胰蛋白酶?jìng)鞔苽涑蓾舛葹?.0×107/mL的懸濁液。

1.2.2 移植瘤動(dòng)物模型

HEC-1-B子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株懸濁液0.2 mL(約含8×106個(gè)細(xì)胞)注射于裸鼠的左前肢。建模成功的標(biāo)志為接種處出現(xiàn)粟粒結(jié)節(jié)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

34 只裸鼠，去除移植瘤結(jié)節(jié)最大及最小的2 只，并將剩余的32 只隨機(jī)分四組：對(duì)照組、低劑量醋酸丙氨瑞林組(20 μg/kg)、中劑量醋酸丙氨瑞林組(40 μg/kg)、高劑量醋酸丙氨瑞林組(80 μg/kg)。按劑量分組飼養(yǎng)，每日給予肌肉注射0.2 mL注射液1 次，觀察28 d后處死裸鼠，取出位于左前肢的皮下移植瘤結(jié)節(jié)。測(cè)量瘤體的長、寬、高，計(jì)算瘤體的體積(V)。計(jì)算抑瘤率(IR)=[(V對(duì)照組)-(V實(shí)驗(yàn)組)/V對(duì)照組]×100%。抑瘤率大于10%為藥敏陽性。

1.2.4 TRF1蛋白表達(dá)檢測(cè)

移植瘤細(xì)胞中TRF1蛋白主要在胞核內(nèi)表達(dá)。病理圖像分析軟件分析各組陽性灰度值，取平均數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量丙氨瑞林干預(yù)后瘤體的變化

按照試驗(yàn)步驟，給予不同劑量的丙氨瑞林干預(yù)后，隨著丙氨瑞林劑量的增加，腫瘤體積逐漸減小。計(jì)算各組的抑瘤率均>10%，將各劑量組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。表明丙氨瑞林可以抑制移植瘤的生長。

2.2 瘤體的細(xì)胞學(xué)改變

對(duì)照組移植瘤組核異型性明顯，染色較深；各丙氨瑞林組細(xì)胞核大小不一，形態(tài)不規(guī)則，瘤細(xì)胞變小、破碎、壞死，細(xì)胞間排列較前明顯稀疏，局部區(qū)域可見片狀無結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)。

表1 不同劑量藥物對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響

2.3 丙氨瑞林與TRF1表達(dá)的關(guān)系

免疫組織化學(xué)法處理后，TRF1蛋白陽性染色呈棕黃色顆粒，主要位于胞核中。通過病理圖像分析進(jìn)行半定量分析，以圖片中目標(biāo)的灰度值反應(yīng)其表達(dá)情況。隨著丙氨瑞林劑量增大，TRF1灰度值增高。對(duì)照組平均灰度值為103.00±6.87，低劑量醋酸丙氨瑞林組灰度值為132.19±7.53，中劑量醋酸丙氨瑞林組灰度值為154.28±6.93，高劑量醋酸丙氨瑞林組灰度值為171.52±10.91。各劑量組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各劑量組免疫組化結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 對(duì)照組免疫組化結(jié)果

圖2 低劑量醋酸丙氨瑞林組免疫組化結(jié)果

圖3 中劑量醋酸丙氨瑞林組免疫組化結(jié)果

圖4 高劑量醋酸丙氨瑞林組免疫組化結(jié)果

3 討 論

促性腺激素釋放激素類似物(GnRH-α)是一種模擬天然GnRH效應(yīng)的九肽類似物，其活性是天然GnRH的十倍甚至百倍，丙氨瑞林為其中一類。對(duì)GnRH的依賴性腫瘤細(xì)胞具有阻礙增殖的作用，主要是依靠阻礙性腺軸和垂體的功能來發(fā)揮的作用，少數(shù)情況下是依靠腫瘤細(xì)胞局部的自分泌以及旁分泌的調(diào)整來完成，即間接抑制下丘腦-垂體-性腺軸或直接與腫瘤細(xì)胞表面的GnRH受體結(jié)合。位于哺乳動(dòng)物染色體末端的端粒是由重復(fù)的DNA序列TTAGGG和蛋白組成，其中的部分蛋白按照一定的順序結(jié)合形成端粒保衛(wèi)蛋白復(fù)合體(Shelterin)。Shelterin屬于端粒蛋白的一種，有6 種蛋白組成，分別為Rap1、TIN2、POT1、TRF1、TPP1及TRF2。在端粒中，這6 種獨(dú)立的蛋白組裝起來與重復(fù)的堿基序列一道，形成復(fù)雜的雙鏈結(jié)構(gòu)。這樣復(fù)雜的DNA-蛋白結(jié)構(gòu)可以使得染色體末端得到保護(hù)，并可以確?；虻姆€(wěn)定性，避免了DNA損傷性的應(yīng)答[3-4]。然而，這些組成成分中的任一部分發(fā)

生結(jié)構(gòu)或功能的異常就有可能引起不良的DNA損傷應(yīng)答，甚至細(xì)胞衰老或凋亡。TRF1于1995年被chong等首次發(fā)現(xiàn)[5]。TRF1的表達(dá)主要位于胞核中，由三個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，分別為：TRF特異性結(jié)構(gòu)域、羧基末端的myb樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、氨基末端的酸性結(jié)構(gòu)域。在端粒的長度調(diào)控方面，TRF1發(fā)揮負(fù)性作用。TRF1以二聚體的形式通過其C端的myb結(jié)構(gòu)域與端粒DNA結(jié)合，促進(jìn)端粒末端的三級(jí)環(huán)狀結(jié)構(gòu)T-Loop的形成，與TRF2一起參與維持基因組的穩(wěn)定性。當(dāng)TRF1啟動(dòng)ATM磷酸化，可參與DNA的損傷響應(yīng)系統(tǒng)，增加細(xì)胞的癌癥易感性。陳煒等[6]研究表明，在前列腺癌中TRF1蛋白的表達(dá)水平位于胞核，且明顯高于前列腺增生組織。但Aragona等[7]對(duì)顱內(nèi)腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)TRF1在胞漿明顯表達(dá)，在正常組織、良性腫瘤中表達(dá)高于惡性腫瘤組。本實(shí)驗(yàn)在建立裸鼠皮下移植瘤模型后，移植瘤在不同劑量的丙氨瑞林組中有變化。隨著丙氨瑞林劑量增加，裸鼠移植瘤的體積降低，與本課題結(jié)果一致，且丙氨瑞林劑量的增加，TRF1表達(dá)的下降，可以推測(cè)丙氨瑞林對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的抑制作用，可能是通過下調(diào)TRF1來實(shí)現(xiàn)的。但是丙氨瑞林抗腫瘤的機(jī)制尚未被完全揭示，有可能是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，希望隨著GnRH抑制腫瘤作用機(jī)制的研究深入，可以被更好地應(yīng)用于臨床。

[1]謝幸，茍文麗，林仲秋，等.婦產(chǎn)科學(xué)[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：313-314.

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[6]陳煒，何麗娜，王勇.端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白TRF1及TRF2在前列腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J].臨床泌尿外科雜志，2016，31(9)：841-845.

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(本文編輯：張紅)

Effection of alarelin on subcutaneous xenograft growth of humanendometrial carcinoma in nude mice and expression of TRF1

LI Hongmei1，ZHANG Sanyuan2，ZHANG Wenying1，F(xiàn)AN Jingjing3

(1.Shanxi Maternal and Child Health Hosipital，Taiyuan 030000，China；2.First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China；3.Shanxi Provincial People′s Hosipital，Taiyuan 030012，China)

Objective：To explore the effect of intervention with Alarelin on telomeric repeat binding factor-1(TRF1) expressions in endometrial cancer and subcutaneously xenografted tumor in nude mice.Methods：Endometrial cancer cell line HEC-1-B cultured in vitro was inoculated into subcutaneous tissue of nude mice to establish xenograft tumor model.34 female nude mice were randomly divided into control group(normal saline)，different dose group(20 μg /kg，40 μg /kg，80 μg /kg).During the period of treatment，our group members measured the size and volume of tumor every seven days.After four weeks，we were removed the xenograft tumor and calculate the volume of tumor.The changes of xenograft morphology were observed by light microscopy with Hematoxylin-easin(HE) staining，and the change of TRF1(TRF1) expressions were estimated by immunohistochemical technology.Results：Alarelin inhibited the tumor growth by 15.03%，21.80%，39.98%，in difference alarelin groups，and the difference was significant between the groups(P<0.05).The hematoxylin-easin staining results showed significant changes.With the increase of alarelin，the expression of TRF1 is decreased.Conclusion：Alarelin have direct inhibitory effect on nude mice who bearing human endometrial carcinoma，which may be associated with the decreased expression of TRF1 protein.

endometrial carcinoma；alarelin；transplanted tumor in nude mice；telomeric repeat binding factor-1

陳世雄(1982— )，男，江西省九江市人，學(xué)士學(xué)位，主治醫(yī)師，主要從事胸外科常見病多發(fā)病的診治工作。

1671-8631(2017)05-0361-03

R737.3

A

2016-12-12

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)