香芹酚脅迫下釀酒酵母的生理特性和轉(zhuǎn)錄組分析

牛力源，孫曉誠，劉靜飛，吳梓浩，白艷紅，張志堅

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，冷鏈食品加工與安全控制教育部重點實驗室，河南省冷鏈食品質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450000；2.商丘師范學院，河南 商丘 476000）

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）是一種兼性厭氧的單細胞真核生物，能夠在低pH值、高滲透壓、營養(yǎng)脅迫等嚴苛環(huán)境下生長，是果蔬食品中常見的腐敗菌之一[1]。與細菌相比，酵母更易于在果蔬食品中生長繁殖，進而影響果蔬食品的貨架期及安全性[2-3]。因此，在果蔬食品的加工、貯藏等過程中，對釀酒酵母的控制措施必不可少。在食品工業(yè)中，通常使用多種化學合成添加劑抑制有害微生物，然而化學合成防腐劑的濫用會產(chǎn)生嚴重的健康風險和環(huán)境危害。近年來，消費者對綠色、天然、安全的食品需求不斷增加，使用天然抑菌劑代替化學合成防腐劑防止食源性病原體的生長和控制食品腐敗已經(jīng)成為食品工業(yè)領(lǐng)域的研究熱點。

香芹酚是一種普遍存在于牛至、百里香等唇形科植物中的天然單萜類苯酚化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎等多種活性功能[4-5]。目前，香芹酚已被國家衛(wèi)生健康委員會和美國食品藥品監(jiān)督管理局等批準用作食品添加劑[6]，廣泛應用于圣女果、蘋果汁、鮮切蘋果等多種食品的防腐保鮮研究中[7-10]，具有提高易腐食品貨架期和安全性的潛力。王新偉等[11]發(fā)現(xiàn)，相比于肉桂醛和檸檬醛，香芹酚具有較高的抗真菌活性。據(jù)Rao等[12]報道，香芹酚對釀酒酵母的抑制作用也顯著強于其他萜酚類化合物（如百里香酚和丁香酚等）。這表明香芹酚在控制果蔬食品中釀酒酵母污染方面具有潛在的應用前景。

然而，目前的研究主要集中于香芹酚對釀酒酵母的體外抗菌活性，食品體系各因素對其抑菌效果的影響尚不清楚。此外，香芹酚對釀酒酵母的抑菌機制也尚未完全闡明。因此，本實驗以釀酒酵母為對象，研究溫度、pH值、果糖等果蔬食品體系中常見的環(huán)境因素對香芹酚抑菌效果的影響規(guī)律，并采用多種細胞生物學手段，評估釀酒酵母細胞形態(tài)、細胞壁膜結(jié)構(gòu)和功能等生理特性的變化，同時利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究香芹酚對釀酒酵母細胞轉(zhuǎn)錄組的影響，分別從細胞水平和分子水平探索香芹酚脅迫抑制釀酒酵母的作用機制，以期為香芹酚在果蔬產(chǎn)品貯藏保鮮中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用菌株釀酒酵母ATCC 204508購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；香芹酚（純度99%）上海麥克林生化科技有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）青島海博生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）（純度99%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；雙(1,3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛爾（bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol，DiBAC4(3)）（純度99%）和TRIzol?regent提取試劑盒 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ATP檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、Fluo-3 AM鈣離子熒光探針 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace?RTreal-time PCR Master Mix 日本東洋紡株式會社。

1.2 儀器與設備

3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Bioscreen C全自動生長曲線儀 芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；TU-1810超微量分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Spark 20M多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；Cytoflex S流式細胞儀 貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司；SU8100高分辨率發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；YXQ-50A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Tiss-24高速組織研磨儀上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；ViiATM7實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將低溫保藏的釀酒酵母接種在YEPD固體培養(yǎng)基上。隨機挑取大小適中的單菌落接種在YEPD液體培養(yǎng)基中，在25 ℃條件下以150 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，即OD600nm為0.8左右。將菌懸液于4 ℃、6 000 r/min離心15 min收集酵母細胞，并用無菌生理鹽水漂洗兩次，收集細胞并重懸于相同體積的無菌生理鹽水中。

1.3.2 香芹酚溶液的制備

將香芹酚原液與吐溫80按1∶1（V/V）混合，充分振蕩混勻，配制初始質(zhì)量濃度為512 mg/mL的香芹酚溶液。采用二倍稀釋法，使用無菌生理鹽水依次稀釋，獲得質(zhì)量濃度為40～1 280 μg/mL的香芹酚溶液。

1.3.3 香芹酚對釀酒酵母的抑菌作用分析

1.3.3.1 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

采用微量肉湯二倍稀釋法對香芹酚的MIC進行測定[13]。分別將釀酒酵母菌懸液（終濃度約為6（lg（CFU/mL）））與1.3.2節(jié)中制備的等體積不同質(zhì)量濃度香芹酚溶液（40～1 280 μg/mL）加入100 孔微量滴定板中，以未加香芹酚的菌懸液作為陽性對照。使用全自動生長曲線儀在25 ℃條件下間隔2 h測定菌液的OD600nm，連續(xù)監(jiān)測40 h。

1.3.3.2 不同條件下香芹酚對釀酒酵母的抑菌效果分析

為研究環(huán)境因素對香芹酚抑制釀酒酵母效果的影響，設計3 組抑菌實驗：1）釀酒酵母菌懸液中加入終質(zhì)量濃度160 μg/mL香芹酚溶液，分別在20、30、40 ℃條件下處理30 min；2）使用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)釀酒酵母菌懸液的pH值（3、3.5、4和4.5），加入終質(zhì)量濃度為160 μg/mL香芹酚溶液，30 ℃處理30 min；3）添加果糖至菌懸液，菌懸液中果糖質(zhì)量濃度分別為40、80、120 g/L和160 g/L，同時加入等體積香芹酚溶液（終質(zhì)量濃度160 μg/mL），在30 ℃條件下處理30 min，果糖終質(zhì)量濃度為20～80 g/L。釀酒酵母活菌數(shù)（lg（CFU/mL））由平板計數(shù)法確定。

1.3.4 香芹酚對釀酒酵母的抑菌機制分析

1.3.4.1 場發(fā)射掃描電鏡（field emission-scanning electron microscopy，F(xiàn)E-SEM）觀察

參考Niu Liyuan等[14]的方法，并略作修改。使用香芹酚（終質(zhì)量濃度160 μg/mL）在30 ℃條件下處理酵母菌懸液30 min。在4 ℃條件下用體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液固定4 h，然后使用不同體積分數(shù)乙醇溶液（10%、30%、50%、70%、80%、90%和100%）進行梯度脫水。將干燥后樣品滴加至硅片，過夜烘干，噴金，通過FE-SEM觀察并采集圖像。

1.3.4.2 細胞膜滲透性的測定

細胞內(nèi)容物泄漏量常被用來評估細胞膜的滲透性[15]。分別向釀酒酵母菌懸液中加入不同終質(zhì)量濃度（20、40、80 μg/mL和160 μg/mL）的香芹酚，在30 ℃條件下處理30 min，收集上清液。使用Nanodrop 2000超微量紫外-可見分光光度計測定上清液的OD260nm。

1.3.4.3 細胞質(zhì)膜完整性的測定

參考Xiang Qisen等[16]的方法評估細胞膜完整性。釀酒酵母經(jīng)香芹酚處理后（處理方法同1.3.4.2節(jié)），收集酵母細胞，與終質(zhì)量濃度3 μmol/L PI溶液混合，在37 ℃條件下避光孵育15 min。漂洗2 次后，利用多功能酶標儀檢測樣品的熒光強度。結(jié)果用PI的相對熒光強度表示，計算參考式（1）：

式中：N1和N0分別為處理組和未處理組酵母懸浮液的熒光強度。

1.3.4.4 細胞膜電位的測定

參考Wang Meng等[17]的實驗方法測定細胞膜電位。分別向釀酒酵母菌懸液中加入不同終質(zhì)量濃度（80、160、320 μg/mL）的香芹酚，在30 ℃條件下處理30 min，收集酵母細胞，與終質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL DiBAC4(3)探針振蕩混勻，在37 ℃條件下避光孵育30 min。漂洗2 次后，使用流式細胞儀檢測釀酒酵母懸浮液的熒光強度。

1.3.4.5 線粒體膜電位的測定

參考Niu Liyuan等[18]的方法，略作調(diào)整。釀酒酵母經(jīng)香芹酚處理后（處理方法同1.3.4.2節(jié)），收集菌體并與等體積JC-1（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylimidacarbocyanine iodide）染色工作液混合均勻，在30 ℃條件下避光孵育20 min。使用多功能酶標儀測定JC-1多聚體（紅色）和JC-1單體（綠色）的熒光強度，激發(fā)/發(fā)射波長分別為525/590 nm和490/530 nm。結(jié)果用線粒體膜電位的相對熒光強度表示，計算參考式（2）：

式中：N3和N2分別為處理組和未處理組樣品的紅、綠熒光強度的比值。

1.3.4.6 細胞內(nèi)ATP含量的測定

采用ATP檢測試劑盒測定ATP含量。經(jīng)香芹酚處理后（處理方法同1.3.4.2節(jié)），收集釀酒酵母細胞并重懸于細胞裂解液中，煮沸10 min后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液。取100 μL ATP檢測工作液加入到96 孔板中，室溫孵育5 min，然后添加100 μL酵母菌裂解液。采用多功能酶標儀檢測10 000 ms的發(fā)光強度。

1.3.4.7 細胞內(nèi)Ca2+含量的測定

釀酒酵母經(jīng)香芹酚處理后（處理方法同1.3.4.2節(jié)），收集菌體重懸浮至Fluo-3 AM熒光染料（終質(zhì)量濃度為10 μmol/L）中，在30 ℃條件下避光孵育30 min。使用無菌生理鹽水漂洗2 次并重懸浮，然后再次孵育25 min。孵育結(jié)束后，使用多功能酶標儀在激發(fā)/發(fā)射波長為488/530 nm處檢測熒光強度。結(jié)果用Ca2+相對熒光強度表示，計算參考式（3）：

式中：N5和N4分別為處理組和未處理組樣品的熒光強度。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組測序分析

使用終質(zhì)量濃度為20 μg/mL香芹酚在30 ℃條件下處理依據(jù)方法1.3.1節(jié)制備的釀酒酵母菌懸液（OD600nm為0.8左右）30 min，對照組不做任何處理。對照組和實驗組均設置3 個生物學重復。委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行RNA提取和RNA-Seq測序。使用DESeq2軟件進行差異表達分析，以|log2差異倍數(shù)|＞1且校正P值（PAdj）小于0.05作為差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選標準。利用clusterProfiler軟件對DEGs進行基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，當PAdj＜0.05時，認為DEGs在該子類中被顯著富集。

1.3.6 real-time PCR驗證

使用RNA提取試劑盒提取各處理組酵母細胞總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，使用real-time PCR儀進行實驗。表1列出了所使用的引物信息，real-time PCR條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15～30 s，循環(huán)45 次；最后72 ℃延伸20 s。以ACT1為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt歸一化法計算基因相對表達量。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酚對釀酒酵母MIC的影響

如圖1所示，當香芹酚質(zhì)量濃度為80 μg/mL時，與未處理組相比，釀酒酵母出現(xiàn)了生長抑制。當香芹酚質(zhì)量濃度低于40 μg/mL時，未表現(xiàn)出對酵母菌生長的抑制作用。當香芹酚質(zhì)量濃度為160 μg/mL時，酵母細胞生長完全被抑制，因此，香芹酚的MIC為160 μg/mL。Chavan等[19]也報道了相似的結(jié)果，香芹酚對分離自釀酒葡萄果表的天然釀酒酵母的MIC為128 μg/mL，這可能是由于實驗方法和使用的菌株不同，導致MIC略有差異。將香芹酚對釀酒酵母的MIC（160 μg/mL）用于后續(xù)環(huán)境因素對香芹酚抑制釀酒酵母效果的影響研究。

圖1 不同質(zhì)量濃度香芹酚作用下釀酒酵母的生長曲線Fig.1 Growth curves of S.cerevisiae cultivated with carvacrol at different concentrations

2.2 環(huán)境因素對香芹酚抑制釀酒酵母效果的影響

如圖2A所示，隨著環(huán)境溫度的升高，香芹酚的抑菌效果不斷增強，在40 ℃時對釀酒酵母菌的抑制作用最強，活菌數(shù)減少了2.23（lg（CFU/mL））。較高的溫度可能增加細胞膜和線粒體膜的流動性，并且能夠提高香芹酚的溶解度，有助于增強酵母菌對香芹酚處理的敏感性[20-21]。

圖2 溫度（A）、pH值（B）、果糖（C）對香芹酚抑制釀酒酵母效果的影響Fig.2 Influence of temperature (A),pH (B) and fructose (C) on the inhibitory effect of carvacrol against S.cerevisiae

考慮到果蔬產(chǎn)品的pH值通常在3～4.5之間，因此研究了該范圍內(nèi)pH值對香芹酚抑制釀酒酵母效果的影響。在不同pH值（7、3、3.5、4和4.5）條件下經(jīng)香芹酚處理后，酵母活菌數(shù)沒有顯著差異（P＞0.05）（圖2B）。以上結(jié)果表明，低pH值環(huán)境（3～4.5）對香芹酚的抑菌效果沒有顯著影響，符合釀酒酵母生長對環(huán)境pH值有較大適應性的特征[22]。

果汁中的果糖是甜味與風味的重要來源，是多數(shù)果汁中主要的糖類物質(zhì)[23-24]。如圖2C所示，果糖的添加降低了香芹酚對釀酒酵母的失活作用。果糖是細胞正常生長代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)，具有促進細胞能量代謝、穩(wěn)定細胞膜等作用，因此在環(huán)境脅迫下，適當濃度的果糖有利于維持酵母細胞活性[25]。

2.3 香芹酚對釀酒酵母細胞形態(tài)的影響

如圖3A所示，未經(jīng)處理的釀酒酵母細胞表面完整，呈規(guī)則的橢圓形或球形，細胞表面沒有明顯的損傷。經(jīng)終質(zhì)量濃度為160 μg/mL的香芹酚在30 ℃條件下處理30 min后，酵母細胞的表面出現(xiàn)不同程度的凹陷（圖3B）。百里香酚為香芹酚的同分異構(gòu)體，區(qū)別在于羥基所在酚環(huán)上的位置不同。Wang Huxuan等[26]發(fā)現(xiàn)62.5 μg/mL百里香酚在28 ℃條件下處理魯氏酵母（Zygosaccharomycesrouxii）18 h會導致細胞表面出現(xiàn)明顯皺縮。這表明細胞壁膜可能是香芹酚、百里香酚等單萜酚類化合物作用于酵母細胞的靶點之一。

圖3 香芹酚對釀酒酵母形態(tài)的影響Fig.3 Effect of carvacrol on the cellular morphology of S.cerevisiae

2.4 香芹酚對釀酒酵母細胞質(zhì)膜通透性和完整性的影響

如圖4A所示，與未處理組相比，香芹酚處理后酵母細胞內(nèi)DNA泄漏量顯著增加，表明細胞膜通透性增加，且與香芹酚質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)。PI探針常被用于評估細胞膜的完整性[27]，香芹酚處理導致釀酒酵母的PI相對熒光強度顯著增加（P＜0.05），當香芹酚質(zhì)量濃度為160 μg/mL時，PI相對熒光強度相對于未處理組增加了2.72 倍（圖4B）。Pei Shaopei等[28]也報道了香芹酚處理會導致炭疽病菌的細胞質(zhì)膜破裂。香芹酚具有較強的親脂性，可以與細胞膜相互作用，溶解在磷脂雙分子層中，在脂肪酸鏈之間排列，影響脂質(zhì)分子間作用力，導致細胞膜的膨脹和不穩(wěn)定，增加其流動性及滲透性，甚至造成細胞膜破裂[29-30]。百里香酚也能夠改變魯氏酵母細胞膜的通透性和完整性，其可能通過氫鍵與膜蛋白疏水區(qū)域結(jié)合，從而改變細胞膜結(jié)構(gòu)[26]。此外，受損的細胞質(zhì)膜可能允許香芹酚進入細胞內(nèi)部，破壞細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，如擾亂與能量產(chǎn)生和結(jié)構(gòu)化合物合成有關(guān)的細胞酶系等，從而增強其抗菌性[31]。

圖4 香芹酚處理對釀酒酵母胞外DNA質(zhì)量濃度（A）和PI相對熒光強度（B）的影響Fig.4 Effect of carvacrol treatment on extracellular DNA content (A) and relative PI fluorescence intensity (B) of S.cerevisiae

2.5 香芹酚對釀酒酵母細胞膜電位的影響

細胞膜電位在pH值穩(wěn)態(tài)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等生理活動中起重要作用[32]。DiBAC4(3)染料可以進入去極化的細胞，通過測定其熒光強度可以評估細胞膜的去極化程度[17]。圖5中左象限細胞亞群代表細胞膜電位正常的酵母細胞，右象限細胞亞群代表細胞膜去極化的酵母細胞。經(jīng)80、160、320 μg/mL香芹酚處理后DiBAC4(3)陽性細胞數(shù)分別比未處理組（41.99%）顯著增加了0.44、0.82、1.32 倍。隨著香芹酚處理濃度的增加，釀酒酵母細胞膜去極化程度逐漸加重，這可能與香芹酚的酚羥基有關(guān)。香芹酚含有的酚羥基可以作為單價陽離子載體，釋放H+，結(jié)合胞內(nèi)K+，并將其轉(zhuǎn)運至細胞外，最終使細胞膜電位發(fā)生改變，影響細胞正常的生命活動[29-30]。

圖5 香芹酚處理對釀酒酵母細胞膜電位的影響Fig.5 Effect of carvacrol on the cell membrane potential of S.cerevisiae

2.6 香芹酚對釀酒酵母線粒體膜電位和胞內(nèi)ATP含量的影響

線粒體膜電位具有合成ATP、驅(qū)動線粒體前體蛋白和代謝物的跨膜轉(zhuǎn)運等重要生理功能[33]。如圖6A所示，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度香芹酚處理后，釀酒酵母細胞的JC-1相對熒光強度顯著降低。這表明香芹酚處理后釀酒酵母線粒體膜電位受到了破壞。線粒體膜電位降低會阻礙ATP的合成和膜電位依賴性運輸，干擾細胞正常的代謝活動[34-35]。經(jīng)香芹酚處理后，酵母細胞內(nèi)ATP含量顯著降低（圖6B）。研究表明，經(jīng)62.5 μg/mL百里香酚處理后，魯氏酵母細胞內(nèi)ATP水平也出現(xiàn)明顯下降[26]，線粒體膜去極化發(fā)生[36]，這與本研究的結(jié)果相一致。線粒體膜的去極化會造成能量的合成受阻。此外，處理后細胞膜完整性的喪失導致胞內(nèi)ATP泄漏也可能是胞內(nèi)ATP含量減少的另一個原因。

圖6 香芹酚處理對釀酒酵母線粒體膜電位（A）和ATP含量（B）的影響Fig.6 Effect of carvacrol on the mitochondrial membrane potential (A) and ATP content (B) of S.cerevisiae

2.7 香芹酚對釀酒酵母細胞內(nèi)Ca2+含量的影響

在真核生物細胞中，Ca2+常作為第二信使，參與調(diào)控細胞的生理活動[37]。正常情況下胞內(nèi)Ca2+含量較低，然而當受到外界環(huán)境脅迫刺激時，細胞可以通過多種途徑使胞外Ca2+內(nèi)流，造成胞內(nèi)Ca2+含量增多，鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡[37]。經(jīng)香芹酚處理后，釀酒酵母細胞內(nèi)Ca2+水平也發(fā)生了顯著變化（圖7）。當香芹酚質(zhì)量濃度升高至80 μg/mL 和160 μg/mL 時，與未處理組相比，胞內(nèi)Ca2+含量分別顯著增加了0.36 倍和1.20 倍（P＜0.05）。百里香酚處理同樣會誘導魯氏酵母細胞內(nèi)Ca2+濃度呈劑量依賴性增加[36]。高濃度的Ca2+可以打開線粒體膜上的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，導致線粒體膜通透化的發(fā)生，誘發(fā)線粒體發(fā)生去極化以及氧化磷酸化解偶聯(lián)，阻礙細胞的能量合成[38-39]。香芹酚脅迫下鈣離子內(nèi)流現(xiàn)象可能與細胞膜膨脹及流動性變化導致鈣離子通道打開有關(guān)[12]。

圖7 香芹酚處理對釀酒酵母細胞內(nèi)Ca2+含量的影響Fig.7 Effect of carvacrol on the Ca2+ content in S.cerevisiae

2.8 差異表達基因分析

為了探究釀酒酵母對香芹酚脅迫的分子響應機制，將20 μg/mL香芹酚處理后釀酒酵母的基因表達譜與未處理組進行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)香芹酚處理后，釀酒酵母細胞中有16 個基因表達上調(diào)，68 個基因表達下調(diào)（PAdj＜0.05）。

2.9 DEGs的GO和KEGG富集分析

如圖8所示，在生物過程方面，DEGs顯著富集于ATP代謝、嘌呤核苷三磷酸代謝等過程中；在細胞組分方面，DEGs在細胞質(zhì)、線粒體等子類中存在顯著富集；在分子功能方面，DEGs則被顯著富集于結(jié)構(gòu)分子活性和核糖體的結(jié)構(gòu)成分兩類中（PAdj＜0.05）。

圖8 香芹酚脅迫下釀酒酵母DEGs的GO功能富集分析Fig.8 GO functional enrichment analysis of DEGs in S.cerevisiae under carvacrol stress

此外，KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示，香芹酚脅迫下DEGs顯著富集于氧化磷酸化和核糖體兩條通路中（PAdj＜0.05）（圖9）。氧化磷酸化發(fā)生在真核生物細胞線粒體內(nèi)膜上，是細胞內(nèi)合成ATP的重要途經(jīng)。這與GO功能富集分析結(jié)果一致。

圖9 香芹酚脅迫下釀酒酵母DEGs的KEGG代謝通路富集分析Fig.9 KEGG metabolic pathway enrichment analysis of DEGs in S.cerevisiae under carvacrol stress

2.10 部分重要基因的差異表達分析

表2為涉及ATP合成代謝（氧化磷酸化）和核糖體功能的差異表達大于2.0 倍（即|log2差異倍數(shù)|＞1）的基因信息。香芹酚處理導致釀酒酵母細胞中呼吸鏈酶復合體中細胞色素c還原酶、細胞色素c氧化酶和ATP合成酶相關(guān)編碼基因的表達水平顯著下調(diào)（PAdj＜0.05）。此外，編碼線粒體核糖體（mitochondrial ribosome，MR）結(jié)構(gòu)蛋白的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平也明顯下調(diào)（PAdj＜0.05）。通過real-time PCR對關(guān)鍵基因（ATP20、COX5A、QCR7、RSM19）的表達進行驗證，結(jié)果如圖10所示，real-time PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果具有較高的可信度。

圖10 基于real-time PCR驗證香芹酚脅迫下釀酒酵母關(guān)鍵DEGs的表達水平Fig.10 Real-time PCR verification of expression levels of key DEGs in S.cerevisiae under carvacrol stress

表2 香芹酚脅迫下釀酒酵母部分關(guān)鍵DEGsTable 2 Key DEGs in S.cerevisiae under carvacrol stress

2.11 香芹酚脅迫抑制釀酒酵母的分子機制

香芹酚脅迫下，釀酒酵母細胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復合體相關(guān)編碼基因的表達受到顯著抑制，表明電子傳遞受到抑制。真核細胞中線粒體膜電位的建立依賴于呼吸鏈中的電子傳遞[40]。由于線粒體膜電位具有重要的生理功能，包括合成ATP、代謝物的跨膜轉(zhuǎn)運等，因此，當電子傳遞受到抑制時，為了維持線粒體膜電位，氧化磷酸化過程中ATP合成酶的功能會發(fā)生逆轉(zhuǎn)，由催化ATP形成轉(zhuǎn)變?yōu)榇呋疉TP分解，同時將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)泵至內(nèi)、外膜間隙[33]。本研究中香芹酚脅迫下酵母細胞線粒體膜電位下降（圖6A），這可能與電子傳遞受阻有關(guān)，這會導致ATP合成減少、消耗增多，與胞內(nèi)ATP含量降低的結(jié)果一致（圖6B）。然而，胞內(nèi)ATP含量過低則會導致細胞壞死[41]。香芹酚脅迫下ATP合成酶的編碼基因顯著下調(diào)，ATP合成酶的減少會降低胞內(nèi)ATP的消耗。此外，香芹酚脅迫對MR結(jié)構(gòu)蛋白合成的抑制作用也是阻礙呼吸鏈電子傳遞的原因之一。香芹酚脅迫下釀酒酵母DEGs顯著富集于MR結(jié)構(gòu)蛋白部分，涉及兩個亞基合成的多個基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（表2），這表明MR蛋白質(zhì)的生物合成受到抑制。MR蛋白參與MR組裝和線粒體翻譯，主要參與線粒體呼吸鏈復合體的生物合成[42]。由此可見，香芹酚脅迫主要通過抑制線粒體呼吸鏈復合體編碼基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯兩種方式抑制電子傳遞，破壞線粒體膜電位，從而擾亂ATP代謝以及依賴線粒體膜電位的細胞活動。此外，作為許多藥物的作用靶點，MR功能障礙還會影響線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等多種生命活動[43-44]。以上轉(zhuǎn)錄組學分析表明，釀酒酵母細胞線粒體電子傳遞受阻與MR功能障礙可能是香芹酚脅迫釀酒酵母的重要機制。

3 結(jié)論

香芹酚能夠抑制釀酒酵母的生長，隨著處理溫度的升高，香芹酚對釀酒酵母的抑制作用逐漸增強，pH值對其抑菌效果沒有顯著影響，然而果糖的添加則會顯著降低其抗菌活性。香芹酚處理后，釀酒酵母細胞壁膜結(jié)構(gòu)和功能紊亂，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，線粒體膜電位降低，胞內(nèi)Ca2+濃度升高、ATP水平下降?；谵D(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，香芹酚脅迫抑制了線粒體呼吸鏈復合體、ATP合成酶以及MR結(jié)構(gòu)蛋白的生物合成，這會阻礙呼吸鏈電子傳遞，干擾MR相關(guān)的生命活動。本研究明確了香芹酚脅迫下釀酒酵母生理特性和轉(zhuǎn)錄組水平的變化規(guī)律，揭示了香芹酚抑制釀酒酵母的潛在作用機制，可為天然防腐劑在果蔬汁產(chǎn)品中的開發(fā)和應用提供理論支持，對有效控制釀酒酵母在食品加工和貯藏過程中的腐敗作用、保護消費者健康具有積極意義。同時，本研究也從分子水平上揭示了可以與香芹酚等類似單萜酚類化合物聯(lián)合作用的其他真菌靶點，可為聯(lián)合抑菌/殺菌技術(shù)的開發(fā)提供理論參考。