合歡花多酚的提取及對亞硝酸鹽的清除作用

袁建梅，汪應靈，李萬里

摘要：通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了合歡花多酚的提取工藝，考察了料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度對合歡花多酚提取率的影響及多酚對亞硝酸鹽的清除作用。結果表明，各因素影響的大小順序為乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞提取溫度＞料液比；提取的最佳工藝條件為料液比１∶２５（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ），乙醇體積分數(shù)５０％，提取時間２．０ ｈ，提取溫度７０ ℃，在此條件下，合歡花多酚提取率為２．５９％；當多酚濃度達到６．０ μｇ／ｍＬ時，對亞硝酸鹽的清除率為７３．９％。

關鍵詞：合歡花；多酚；提取工藝；亞硝酸鹽

中圖分類號：Ｑ９４９．７５１．９；Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）14－3056-03

Extraction of Polyphenol from Flower of Albizia julibrissin and Its Nitrite

Scavenging Ability

ＹＵＡＮ Ｊｉａｎ－ｍｅｉ，ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｌｉｎｇ，ＬＩ Ｗａｎ－ｌｉ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｆｒｏｍ ｆｌｏｗｅｒ ｏｆ Ａｌｂｉｚｉａ ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｎｉｔｒｉｔｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｒａｎｋｅｄ ａｓ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ＞ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ＞ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ＞ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， １∶２５（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）； ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ， ５０％； ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ， ２ ｈ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，７０ ℃． Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ２．５９％． Ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｔｅ ｗａｓ ７３．９％ ｗｈｅｎ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ６ μｇ／ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｌｏｗｅｒ ｏｆ Ａｌｂｉｚｉａ ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ； ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｎｉｔｒｉｔｅ

合歡花為豆科植物合歡（Ａｌｂｉｚｚｉａ ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ Ｄｕｒａｚｚ．）的干燥花序［１］，是一種藥食同源植物，主要生長在華東、華南、西南的路旁、林邊及山坡上，具有解郁安神、和絡止痛之功效，治肝郁胸悶、憂而不樂、心神不安、憂郁失眠［２，３］。合歡花含有多酚、多糖等多種活性成分，多酚的分子結構中有多個酚羥基，具有獨特的藥理和生理活性，可以抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)靜、防癌抗癌、抗輻射、預防心血管疾病等［４－６］，此外，多酚對亞硝酸鹽也有一定的清除作用［７］。然而，已報道的對合歡花多酚的提取及其對亞硝酸鹽的清除作用的研究較少。

采用乙醇提取法［８，９］考察了合歡花多酚提取的主要影響因素，優(yōu)化了提取的工藝條件，探討了合歡花多酚對亞硝酸鹽的清除作用，為開發(fā)利用合歡花的藥用和保健功能提供科學依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料與試劑合歡花購自新鄉(xiāng)市張仲景大藥房；沒食子酸對照品購自中國食品藥品檢定研究所，批號１１０８３１－２００８０３；１ ｍｏｌ／Ｌ Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試劑購自天津市光復精細化工研究所；石油醚、無水乙醇、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺均為分析純。

１．１．２儀器與設備７５２型紫外可見分光光度計購自上海菁華科技儀器有限公司，ＨＨ－４型數(shù)顯恒溫水浴鍋購自常州國華電器有限公司，ＳＢＨ－ＩＩ循環(huán)水式真空泵購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司，ＢＳ２４４電子分析天平購自德國賽多利斯公司，Ｒ２０６Ｄ旋轉蒸發(fā)器購自上海申生科技有限公司。

１．２方法

１．２．１工藝流程合歡花多酚提取的工藝流程為：合歡花→粉碎→用石油醚脫脂→用乙醇提取→抽濾→濾液→定容→測定多酚濃度。

１．２．２單因素試驗選擇乙醇為提取劑，將提取次數(shù)確定為溶劑提取法常用的２次，選擇乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度４個影響多酚提取率的因素進行單因素試驗。

１）乙醇體積分數(shù)對多酚提取率的影響。準確稱取２．０００ ０ ｇ合歡花粉末５份，分別用４０ ｍＬ體積分數(shù)為４０％、５０％、６０％、７０％、８０％的乙醇在６０ ℃水浴中提?。保?ｈ，提取２次，測定多酚提取率。

２）料液比對多酚提取率的影響。準確稱?。玻埃埃?０ ｇ合歡花粉末５份，分別加入體積分數(shù)為５０％的乙醇２０、３０、４０、５０、６０ ｍＬ，使料液比分別為１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同），在６０ ℃水浴中提?。保?ｈ，提取２次，測定多酚提取率。

３）提取時間對多酚提取率的影響。準確稱?。玻埃埃?０ ｇ合歡花粉末５份，用４０ ｍＬ體積分數(shù)為５０％的乙醇在６０ ℃水浴中分別提取０．５、１．０、２．０、３．０、４．０ ｈ，提?。泊危瑴y定多酚提取率。

４）提取溫度對多酚提取率的影響。準確稱取２．０００ ０ ｇ合歡花粉末4份，分別在５０、６０、７０、８０ ℃水浴中，用４０ ｍＬ體積分數(shù)為５０％的乙醇提?。玻?ｈ，提?。泊?，測定多酚提取率。

１．２．３正交試驗在單因素試驗的基礎上，以料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度為４種因素，取各種因素的３個水平進行Ｌ９（３４）正交試驗，測定合歡花的多酚提取率，正交試驗的因素與水平見表１。

１．２．４合歡花多酚濃度的測定［１０］

１）標準品溶液的配制。準確稱取０．１１７ ６ ｇ沒食子酸，用去離子水溶解并定容至１００ ｍＬ，準確移?。?ｍＬ至５０ ｍＬ容量瓶，并用去離子水定容，制得１１７．６ μｇ／mＬ沒食子酸溶液。

２）標準曲線的繪制。準確移?。?、０．１０、０．２０、０．２５、０．３０、０．４０、０．５０ ｍＬ １１７．６ μｇ／Ｌ沒食子酸溶液于１０ ｍＬ容量瓶，分別加入１．００ ｍＬ Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試劑，立即混勻，再分別加入２．５０ ｍＬ ７５ ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３，用去離子水定容，在５０ ℃反應２ ｈ，以試劑空白為參比溶液，在７６０ ｎｍ波長處測定吸光度。根據(jù)所測數(shù)據(jù)求得標準方程為：＝０．１２９ ２c＋０．０１６ １，相關系數(shù)ｒ＝０．９９９ ９，式中Ａ為吸光度，c為沒食子酸濃度（μｇ／ｍＬ）。在沒食子酸濃度為１.176～5.880 μｇ／ｍＬ時，濃度與吸光度呈良好的線性關系。

３）多酚濃度的測定。準確稱取合歡花粉末２．０００ ０ ｇ，在不同條件下提取，抽濾提取液，合并濾液，濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)器濃縮至３０ ｍＬ左右，用體積分數(shù)為６０％的乙醇定容至１００ ｍＬ。準確吸?。保埃?ｍＬ提取液于１０ ｍＬ容量瓶中稀釋１０倍，再準確吸?。保埃?ｍＬ稀釋后的提取液于１０ ｍＬ容量瓶中，測定吸光度，利用標準方程求得多酚濃度c。

多酚提取率＝×１００％

式中，c為多酚濃度，μｇ／ｍＬ；Ｖ為提取液體積，ｍＬ；Ｎ為樣品稀釋倍數(shù)；ｍ為未脫脂前原料的質量，ｇ。

１．２．５合歡花多酚對亞硝酸鹽的清除試驗參考鹽酸萘乙二胺比色法［１１］測定。準確移?。玻埃?ｍＬ １０ μｇ／ｍＬ ＮａＮＯ２溶液于５０ ｍＬ容量瓶中，再加入不同體積的合歡花多酚提取液，使終濃度分別為０．４、０．６、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４、３．６、４．８和６．０ μｇ／ｍＬ，搖勻后避光反應３０ ｍｉｎ，然后加入２．００ ｍＬ ４ ｇ／Ｌ對氨基苯磺酸，搖勻靜置５ ｍｉｎ，加入１ ｍＬ ２ ｇ／Ｌ鹽酸萘乙二胺，搖勻，加去離子水定容，靜置１５ ｍｉｎ，以試劑空白為參比溶液，在５４０ ｎｍ處測定吸光度，按照下式計算清除率：清除率＝［（Ａ對照－Ａ樣品）／Ａ對照］×１００％，式中，Ａ對照為不加合歡花多酚提取液的吸光度；Ａ樣品為添加合歡花多酚提取液的吸光度。

２結果與分析

２．１單因素試驗結果

２．１．１乙醇體積分數(shù)對多酚提取率的影響從圖１可知，多酚提取率先隨著乙醇體積分數(shù)的增大而增大，當乙醇體積分數(shù)達到５０％時多酚提取率最高，而乙醇體積分數(shù)再繼續(xù)增大時，提取率呈下降趨勢?？赡苁且驗楫斠掖俭w積分數(shù)較低時糖類等水溶性物質溶出，影響多酚溶出，隨著乙醇體積分數(shù)增大，溶劑極性與合歡花多酚極性相似，使提取率增加，當乙醇體積分數(shù)再繼續(xù)增大時，溶劑與合歡花多酚極性相差較遠，而且其他脂溶性物質溶出，影響測定，所以初步確定體積分數(shù)為５０％的乙醇是較為理想的提取劑。

２．１．２料液比對多酚提取率的影響由圖２可知，多酚提取率隨料液比的減小而增大，當料液比達到１∶２０后，多酚提取率趨于平穩(wěn)。料液比越小，濃縮時間越長，多酚被氧化的幾率越大，綜合考慮多酚提取率、溶劑用量及能耗，選擇料液比為１∶２０。

２．１．３提取時間對多酚提取率的影響由圖３可知，隨著提取時間的延長，多酚提取率先增加，當提取時間超過２．０ ｈ后多酚提取率略有下降，可能是提取時間太長使得部分多酚被氧化，而且提取時間長使得能耗增加，所以２．０ ｈ為適宜的提取時間。

２．１．４提取溫度對多酚提取率的影響由圖４可知，隨著提取溫度的升高，多酚提取率先升高，當提取溫度達到７０ ℃時提取率最高，提取溫度進一步升高提取率反而下降。由于多酚含有多個酚羥基，其在高溫下化學性質活潑，可以發(fā)生氧化、縮合等化學反應，因此高溫使多酚的提取率降低，而且隨著提取溫度的升高，多酚易氧化變性，所以７０ ℃是較適宜的提取溫度。

２．２正交試驗結果

由表２可知，Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ ４種因素對合歡花多酚提取率影響的主次順序為Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ａ，即乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞提取溫度＞料液比；各因素的最優(yōu)組合為Ａ３Ｂ２Ｃ２Ｄ２，即料液比１∶２５，乙醇體積分數(shù)５０％，提取時間２．０ ｈ，提取溫度７０ ℃，其結果與單因素結果基本一致。

在正交試驗得出的最佳提取條件下進行３次試驗，合歡花多酚提取率分別為２．５８％、２．５９％、２．６１％，平均值為２．５９％，高于單因素試驗和正交試驗中所有試驗組合的提取率，而且重現(xiàn)性好，表明該工藝穩(wěn)定可行。

２．３合歡花多酚對亞硝酸鹽的清除作用

合歡花多酚與維生素Ｃ（ＶＣ）對ＮＯ２－的清除作用見圖５。由圖５可知，合歡花多酚提取液對ＮＯ２－有明顯的清除作用，清除率隨著合歡花多酚濃度的增加而增加，當多酚濃度達到６．０ μｇ／ｍＬ時清除率為７３．９％；合歡花多酚對ＮＯ２－的清除率不及ＶＣ，而且濃度越小，兩者的清除率差別越大。

３結論

１）通過單因素試驗及正交試驗對合歡花多酚提取工藝條件進行優(yōu)化，結果表明，影響合歡花多酚提取率的主次順序為：乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞提取溫度＞料液比；最優(yōu)工藝條件為料液比１∶２５，乙醇體積分數(shù)５０％，提取時間２．０ ｈ，提取溫度７０ ℃，在此條件下，多酚提取率為２．５９％。

２）合歡花多酚提取液對ＮＯ２－有明顯的清除作用，當多酚濃度達到６．０ μｇ／ｍＬ時清除率為７３．９％，其清除率不及維生素Ｃ。

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