不同濃度過氧化脲對牙齦上皮細(xì)胞生長影響的實(shí)驗(yàn)研究

郭紅延　王曉玲　朱曉英　伊元夫

[摘要]目的：評價不同濃度過氧化脲對體外培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞生長的影響，獲得不同濃度過氧化脲引起人牙齦上皮細(xì)胞凋亡的時間范圍。方法：體外培養(yǎng)人牙齦上皮細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，采用含10%及20%過氧化脲的EpiLife上皮細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選取不同時間段計算細(xì)胞死亡率。結(jié)果：體外培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞為多邊形并呈鋪路石狀外觀，角蛋白染色陽性，含10%過氧化脲培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)90s后細(xì)胞大量死亡，含20%過氧化脲培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)60s后細(xì)胞大量死亡。結(jié)論：過氧化脲對體外培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，臨床常用過氧化脲污染牙齦時間不能超過1min。

[關(guān)鍵詞]過氧化脲；牙齦上皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號]R783.1Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）08-1337-03

隨著人們對美的不斷追求，牙齒美容越來越被人們所重視，牙齒漂白是牙齒美容的一部分，它是根據(jù)氧化置換的原理，將牙齒內(nèi)的色素置換出來，以達(dá)到牙齒美白的目的。過氧化脲是常用的牙齒漂白劑之一，隨著臨床牙齒漂白應(yīng)用的增多以及家庭漂白的普及，過氧化脲的安全性越來越受到重視[1-2]。

在牙齒漂白的臨床操作過程中，與牙齒位置最近的牙齦是最容易受到氧化劑損傷的組織[3]，本研究以體外培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞為研究對象，研究不同作用時間下過氧化脲對人牙齦上皮細(xì)胞的損傷，為臨床過氧化脲的安全應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1 材料：DMEM培養(yǎng)基（Sigma 美國）；胎牛血清（FCS Gibco，美國）；EpiLife角化上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（Cascade Biologics，USA）；胰蛋白酶（Sigma 美國）；兔抗人角蛋白多克隆抗體（MAXIM-BIOTECH，美國）；鼠抗兔IgG（MAXIM-BIOTECH，美國）；SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 選取臨床冠延長術(shù)患者，簽署知情同意書，切取健康牙齦組織，置入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)室中修剪所獲得的牙齦組織，剪除纖維結(jié)締組織，用含100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的D-Hank's液反復(fù)清洗，浸泡20min，然后剪成約0.5mm3的組織塊，均勻鋪于培養(yǎng)瓶底，5%CO2培養(yǎng)箱中倒置2h，然后加入15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，3天后觀察有上皮細(xì)胞自組織塊邊緣爬出并生長，繼續(xù)培養(yǎng)7天后換用EpiLife上皮細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至約瓶底的70%～80%時進(jìn)行傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞爬片、鑒定：在培養(yǎng)皿中置入消毒的蓋玻片，將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞消化后接種于消毒的蓋玻片表面，靜置24h后加入培養(yǎng)液，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)后第10天，取出生長有上皮細(xì)胞的蓋玻片，PBS液沖洗干燥制備原代培養(yǎng)的細(xì)胞爬片。角蛋白抗體染色采用即用型SABC免疫組化染色試劑盒（博士德公司），一抗為1∶500兔抗人角蛋白多克隆抗體，二抗為生物素標(biāo)記的鼠抗兔IgG，第2層為酶標(biāo)生物素-卵白素復(fù)合物，DAB顯色，中性樹膠封片。PBS作空白對照，同時設(shè)立成纖維細(xì)胞組為陰性對照組。

2結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果：組織塊貼壁后，第三天開始有上皮細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，并以組織塊為中心向四周生長，細(xì)胞呈多邊形，緊密排列，呈鋪路石狀外觀。細(xì)胞核大而圓或者卵圓形，有多個核仁，胞漿豐滿，細(xì)胞分布均勻，大小一致。培養(yǎng)至7～10天時改用EpiLife上皮細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變，但細(xì)胞體積有所減小，排列稍松散。待到細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞貼壁后分布均勻，形態(tài)以多邊形為主出現(xiàn)多樣化。細(xì)胞來源鑒定：細(xì)胞免疫組化染色顯示胞漿內(nèi)呈棕黃絲網(wǎng)狀，表明角蛋白陽性。

3討論

過氧化脲（carbamide peroxide，CP）又稱過碳酰胺、過氧化氫尿素、過氧化碳酰胺，是尿素和過氧化氫所形成的加合物，兼有尿素和過氧化氫的特性，尿素的氨基既能中和過氧化氫的酸性，又克服了過氧化氫難以儲存和運(yùn)輸?shù)娜秉c(diǎn)。過氧化脲理論活性氧含量為17.0%，同其它的幾種過氧化物相比，過氧化脲具有活性氧值高，水溶液pH值低，穩(wěn)定性好，溶解度大，釋氧速度慢，作用時間長，用后無殘余毒性，對皮膚刺激性、破壞性小等優(yōu)點(diǎn)，因此，臨床上過氧化脲是最常用的漂白劑之一[4]。早在20世紀(jì)60年代末，有國外學(xué)者就將10%的過氧化脲放置于為患者專門制作的托盤中，這樣患者就可以在家中自行漂白。20世紀(jì)90年代初，有學(xué)者報道了活髓牙夜間漂白技術(shù)，因其安全、有效、方便而深受醫(yī)患雙方的青睞[5]。

一般來講1%～10%的CP用于家庭漂白，30%～35%的CP常用于診室漂白。10%CP是常用家庭漂白劑，因其安全性和有效性，現(xiàn)已被美國牙醫(yī)協(xié)會（American Dental Association， ADA）接受[6]。目前，家庭漂白劑使用的濃度有增高趨勢，15%～35%的CP已出現(xiàn)在家庭漂白劑市場上。有制造商和臨床醫(yī)生宣稱濃度高于10%的CP可以獲得更滿意的臨床漂白效果[7]。

然而，過氧化脲作為一種強(qiáng)氧化劑，其細(xì)胞刺激性也深為臨床醫(yī)生們所擔(dān)憂，濃度越高，其針對組織與細(xì)胞所產(chǎn)生的刺激性作用就越大，有學(xué)者研究了相關(guān)過氧化氫及過氧化脲針對成纖維細(xì)胞以及牙齦成纖維細(xì)胞的毒性作用[8]，但作為臨床漂白劑的使用，其最主要的接觸對象是牙齦上皮組織，也就是說，牙齦上皮細(xì)胞對過氧化脲的毒性反應(yīng)應(yīng)該是醫(yī)生及使用者最為關(guān)心的。牙齦上皮細(xì)胞的培養(yǎng)不論從取材到原代培養(yǎng)，都比較困難，在取材方面，由于正常牙齦組織需要臨床切除的患者較少，只能從冠延長術(shù)以及種植手術(shù)過程中獲得，因此臨床取材需要有一定的限制。在細(xì)胞培養(yǎng)方法上，牙齦上皮細(xì)胞的培養(yǎng)一般有組織塊法及酶消化法兩種方法，傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法一般采用含血清的低糖或者高糖DMEM培養(yǎng)基，血清具有營養(yǎng)、促進(jìn)細(xì)胞和組織貼附、促進(jìn)生長的作用，在組織塊法細(xì)胞培養(yǎng)的初期可以增加組織塊的貼壁率以及細(xì)胞從組織塊邊緣的爬出。而酶消化法成功培養(yǎng)牙齦上皮細(xì)胞較為困難。本研究采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代人牙齦上皮細(xì)胞培養(yǎng)，然后更換EpiLife上皮細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，最后獲得分化良好，數(shù)量足夠的牙齦上皮細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)方法是一種非常敏感的細(xì)胞毒性試驗(yàn)法，有學(xué)者采用體外培養(yǎng)的細(xì)胞系檢測口腔應(yīng)用藥物的細(xì)胞毒性[9]，但該方法有一定的局限性，一般只能提供有關(guān)物種細(xì)胞對材料反應(yīng)的信息，由于體外培養(yǎng)和體內(nèi)環(huán)境的差別，這種方法不能提供體內(nèi)有關(guān)組織對材料如何反應(yīng)的信息。本研究采用臨床常用10%和20%過氧化脲濃度配制EpiLife上皮細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基，對體外培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含10%濃度過氧化脲的培養(yǎng)基處理90s后，細(xì)胞開始大量死亡，而含20%濃度過氧化脲的培養(yǎng)基處理60s后，細(xì)胞開始大量死亡。結(jié)果表明，臨床常用濃度的過氧化脲對牙齦上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，隨著接觸時間的延長，其對細(xì)胞的破壞作用也越大。體外培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞因?yàn)槠渑囵B(yǎng)環(huán)境以及細(xì)胞間相互連接都和體內(nèi)有很大區(qū)別，這就使得體外培養(yǎng)的牙齦上皮細(xì)胞較為脆弱，本研究所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)只是針對體外培養(yǎng)的人牙齦上皮細(xì)胞，含同樣濃度的過氧化脲美白產(chǎn)品對口內(nèi)牙齦上皮產(chǎn)生損害的時間應(yīng)該相應(yīng)的長一些。

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[收稿日期]2012-02-26[修回日期]2012-04-12

編輯/張惠娟