鞘內(nèi)注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體緩解大鼠骨癌痛的機(jī)制

陸向榮，王楓，魏金榮，周友浪，繆秀華，肖穎，徐為袁（.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院手外科，江蘇昆山 500；.蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，江蘇 蘇州5；.蘇州大學(xué)附屬張家港第一人民醫(yī)院骨科，江蘇 張家港 5600）

鞘內(nèi)注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體緩解大鼠骨癌痛的機(jī)制

陸向榮1，王楓1，魏金榮2，周友浪2，繆秀華3，肖穎2，徐為袁3
（1.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院手外科，江蘇昆山 215300；2.蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，江蘇 蘇州215123；3.蘇州大學(xué)附屬張家港第一人民醫(yī)院骨科，江蘇 張家港 215600）

目的：探討腫瘤壞死因子-α（TNF-α）單克隆抗體對脛骨癌痛模型大鼠痛覺過敏的影響及其可能的機(jī)制。方法：選取180～200 g健康雌性 SD大鼠32只，隨機(jī)分成4組（n=8）:假手術(shù)組、骨癌痛組、TNF-α單克隆抗體組、腫瘤對照組。于左側(cè)脛骨近端骨髓腔注射 Walker256腫瘤細(xì)胞懸液10 μL（2×109）制備大鼠骨癌痛模型，假手術(shù)組注射10 μL生理鹽水。建模后第11天，TNF-α單克隆抗體組連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射 TNF-α單克隆抗體依那西普8 μL，腫瘤對照組連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射生理鹽水8 μL，其余兩組不進(jìn)行鞘內(nèi)注射。分別于注射腫瘤細(xì)胞前，注射后第1、4、7、10、14、17天時測定假手術(shù)組和骨癌痛組的機(jī)械痛閾。于接種細(xì)胞后第17天取大鼠左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG，腰 2-腰 5段）測定電壓門控鈉離子通道1.8（NaV1.8）的蛋白表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，骨癌痛組種瘤后第 7天，機(jī)械痛閾開始下降，第10天出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05），第17天骨癌痛組DRG NaV1.8表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；第11天 TNF-α單克隆抗體組大鼠鞘內(nèi)給藥后機(jī)械痛閾明顯升高，2 h達(dá)最高峰，8 h后恢復(fù)到給藥前水平（P＜0.01）；重復(fù)給藥7 d，行為學(xué)變化類似一次給藥，但機(jī)械痛閾值升高程度較單次給藥降低。第17天 TNF-α單克隆抗體組 DRG NaV1.8的表達(dá)較腫瘤對照組明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論:TNF-α單克隆抗體可能通過抑制 DRG神經(jīng)元上的 NaV1.8的高表達(dá)從而抑制骨癌疼痛。

骨癌痛；背根神經(jīng)節(jié)；腫瘤壞死因子-α；電壓門控鈉離子通道1.8

［Abstract］Objective:To investigate the analgesic effect of TNF-α monoantibodies on the development of bone cancer pain in rats and its possible mechanism involved.Methods:Thirty-two（n=32）normal female Sprague-Dawley rats weighting 180-200 g were randomly divided into 4 groups（n=8 for each group）:sham operation group，bone cancer pain group，TNF-α monoantibody group and vehicle group. The rat model of bone cancer pain was induced by injection of breast cancer cells（Walker 256）10 μL（2 ×107cell）into the left proximal tibia bone marrow cavity.Sham operation group was injected by 10 μL normal saline.On the 11thday after inoculation，TNF-α monoantibody group received intrathecal injection of 8 μL TNF-α monoantibodies（etanercept）once daily for consecutive 7 days. The vehicle group received 8 μL intrathecal injection of normal saline solution for consecutive 7 days，while the rest two groups without intrathecal injection. Mechanical pain threshold was measured before inoculation and on day 1，4，7，10，14，17 after inoculation.On day 17 after inoculation，the left side dorsal root ganglion（DRG，L2to L5）were harvested to detect the expression of voltage-gated sodium channel NaV1.8.Results:Compared with sham operation group，the mechanical pain threshold began to decline on day 7 after inoculation andsignificantly decreased on day 10 after inoculation in bone cancer pain group（P＜0.05）.On day 17，NaV1.8 in the DRGs of bone cancer pain group expressed significantly higher than it in sham operation group （P＜0.05）；On day 11 the mechanical pain threshold increased dramatically in TNF-α antibody group，reached peak at 2 h after drug injection and returned to baseline level at 8 h（P＜0.01）.The behavioristics change was similar to the first dose，but the increase of the mechanical pain threshold was decreased after repeated injection for 7 days.On day 17 the expression of NaV1.8 in TNF-α monoantibody group was much lower than it in the control group（P＜0.01）.Conclusion:The TNF-α monoantibody reduced bone cancer pain which may be through inhibiting the high expression of NaV1.8 in DRG.

［Key words］bone cancer pain；dorsal root ganglion；TNF-α；voltage-gated sodium channel NaV1.8

隨著老齡化社會臨近，癌癥已成為威脅人類健康的首要?dú)⑹?，而疼痛特別是癌轉(zhuǎn)移性疼痛是癌癥患者常見的并發(fā)癥。目前，癌性疼痛的發(fā)病機(jī)制尚不明確。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是外周和中樞痛敏的重要參與者［1］。研究發(fā)現(xiàn)接種癌細(xì)胞后，脊髓中 TNF-α的表達(dá)水平增加［2］，TNF-α參與了骨癌痛的發(fā)生和維持［3］。鞘內(nèi)注射TNF-α單克隆抗體能緩解 TNF-α誘發(fā)的神經(jīng)損傷和腫瘤相關(guān)的痛行為［4］，但其詳細(xì)的分子機(jī)制仍不明確。在坐骨神經(jīng)慢性壓迫大鼠模型（chronic constriction injury of the sciatic nerve model，CCI）中［5］，TNF-α的受體（TNFR）在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）中的表達(dá)均顯著增加；抗TNF-α的治療顯著降低了 DRG中 TNFR的表達(dá)，并緩解了CCI模型中的神經(jīng)病理性疼痛。

DRG作為痛覺傳入的第一級神經(jīng)元在痛覺的外周敏化機(jī)制中起著極為重要的作用。DRG神經(jīng)元不僅含有傳遞傷害性感覺的神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)，也含有一系列在疼痛中起重要作用的受體及離子通道，其中電壓門控鈉離子通道（voltage-gated sodium channel，NaV）是可興奮細(xì)胞產(chǎn)生電沖動的特異性蛋白分子，位于可興奮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。根據(jù)對神經(jīng)毒素河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）的敏感性不同，分為TTX敏感型（tetrodotoxin sensitive，TTX-S）和TTX耐受型（tetrodotoxin resistant，TTX-R）。NaV目前共有NaV1.1～NaV1.9等9種亞型，其中至少有6種存在于DRG神經(jīng)元上［6-8］。NaV1.7介導(dǎo) TTX-S鈉電流，其特征的改變參與了糖尿病神經(jīng)病理性疼痛和炎性疼痛［9］。TNF-α可以通過核因子-κB（NF-κB）介導(dǎo)的通路來上調(diào)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型中DRG NaV1.7的表達(dá)［10］。NaV1.8為感覺神經(jīng)元特有，主要在DRG小直徑 C纖維神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他部位沒有發(fā)現(xiàn)。NaV1.8介導(dǎo)了 TTX-R鈉電流［11］，在正常的痛覺功能和炎性疼痛中起重要作用；并且 NaV1.8基因在骨癌痛模型大鼠 DRG中的 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，提示該通道可能也參與骨癌痛的發(fā)生過程［12］。由此推測，TNF-α可能通過調(diào)控DRG中NaV1.8的蛋白表達(dá)來誘發(fā)骨癌痛。

本研究主要探討 TNF-α單克隆抗體是否能抑制骨癌痛及其可能的外周機(jī)制。實驗首先在脛骨腔內(nèi)注射Walker256腫瘤細(xì)胞建立大鼠骨癌痛模型，然后檢測鞘內(nèi)注射 TNF-α單克隆抗體后大鼠痛行為的改變和大鼠DRG（L2-L5）NaV1.8通道蛋白表達(dá)的變化，驗證 TNF-α單克隆抗體通過調(diào)控 NaV1.8的蛋白表達(dá)來抑制骨癌痛的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級健康 SD雌性大鼠 32只，體質(zhì)量180～200 g（蘇州大學(xué)實驗動物中心提供），動物飼養(yǎng)室溫為（22±2）℃，相對濕度40％～60％，自由進(jìn)食和飲水，晝夜交替適應(yīng)1周。大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、骨癌痛組、TNF-α單克隆抗體組、腫瘤對照組，每組8只。

1.2 主要試劑和儀器

Walker256腫瘤細(xì)胞（蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所提供）；TNF-α單克隆抗體依那西普（惠氏公司，25 mg/瓶）；Von Frey Filament機(jī)械痛測量儀。

1.3 方法

1.3.1 骨癌痛模型的建立 參照姚明等［13］的方法制備脛骨癌痛模型。體外培養(yǎng)Walker256腫瘤細(xì)胞，調(diào)整密度為2×109/mL。麻醉狀態(tài)下，于大鼠左脛骨上端切開約5 mm小口，用針尖在脛骨干骺端穿刺打孔，假手術(shù)組注入10 μL生理鹽水，其余組分別注入10 μL Walker256腫瘤細(xì)胞懸液，骨蠟封閉穿刺孔，外涂紅霉素眼膏防止感染。

1.3.2 鞘內(nèi)注射 鞘內(nèi)給藥參照 Hylden等［14］的

方法，在腰5-6之間的椎間孔進(jìn)針將藥物注入蛛網(wǎng)膜下腔。TNF-α單克隆抗體組大鼠在腫瘤細(xì)胞接種后第11-17天鞘內(nèi)注射TNF-α單克隆抗體依那西普50 μg，約8 μL（預(yù)實驗已行量效分析，確定最優(yōu)劑量為50 μg），腫瘤對照組注射相同體積的生理鹽水。

1.3.3 行為學(xué)檢測 行為學(xué)檢測于大鼠接種前1 d，接種后第1，4，7，10，14，17天以及第11，17天鞘內(nèi)注射前0.5 h、鞘內(nèi)注射后 0.5，2，4，6，8 h進(jìn)行，觀察大鼠左后肢的機(jī)械性痛反應(yīng)閾值。機(jī)械性刺激痛敏反應(yīng)閾值（PWT）:根據(jù) Chaplan等［15］報道的方法，用 Von Frey細(xì)絲測定大鼠左側(cè)后爪機(jī)械縮足反射閾值。將大鼠置于干凈的底部為0.5 cm×0.5 cm鐵絲網(wǎng)空格的有機(jī)玻璃箱（15 cm×20 cm×30 cm）內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境10 min；采用Von Frey纖維絲刺激大鼠左后肢足底中部，大鼠出現(xiàn)抬足、舔足或躲避等行為視為陽性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)；刺激強(qiáng)度從0.9 g（根據(jù)纖維絲粗細(xì)度換算）開始，逐漸加力使毛針彎曲至超過原軸1 cm，若大鼠不出現(xiàn)上述反應(yīng)，則換大一級力度的纖維絲；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度的刺激，直至出現(xiàn)第1次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，記錄此時 Von Frey纖維絲的力度，反應(yīng)大鼠機(jī)械痛域；兩次刺激之間至少間隔約15 s。1.3.4 蛋白質(zhì)印跡測定 NaV1.8蛋白 ①DRG分離:接種后第17天，將大鼠斷頭處死，剪取大鼠胸11至骶椎椎體，顯微鏡下小心剪取大鼠左側(cè)脊髓DRG放入低溫、通氧的DRG解剖液（130 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L KH2PO4，1.5 mmol/L CaCl2，6 mmol/L MgSO4，10 mmol/L葡萄糖 和10 mmol/L HEPES；pH值:7.2，滲透壓:305 mOsm）中，修剪后迅速置于液氮，放入-80℃冰箱中保存。②蛋白的提取及濃度測定:從 -80℃ 的冰箱中取出 DRG置于冰上融化后放入勻漿器中，加裂解液（1 g組織加入10 mL的細(xì)胞裂解液和100 μL的PIC），充分研磨后裝離心管，4℃ 15 000 r/ min離心30 min，取上清。用 BCA蛋白測定試劑盒測蛋白濃度。③蛋白表達(dá)測定:根據(jù)所測定的蛋白濃度，取適量上清，加緩沖液后常溫100 V電泳3 h。SDS-PAGE后，凝膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min。剪與膠相同大小的 PVDF膜（甲醇激活）和超厚濾紙，放入轉(zhuǎn)移緩沖液，浸泡15～30 min。于Bio-Rad中濕轉(zhuǎn)，條件為4℃，用恒流 200 mA 2～3 h。轉(zhuǎn)印后的PVDF膜置封閉液（5％脫脂奶粉）中4℃過夜，然后將包被過夜的膜用 TBST漂洗10 min×3次。孵一抗:加入用含有5％脫脂奶粉和0.1％疊氮鈉的TBS配制的 NaV1.8單克隆抗體（1∶200）和鼠抗β-肌動蛋白單克隆抗體（1∶1 000），室溫孵育2 h，TBST漂洗10 min×3次。孵二抗:加入用含有5％脫脂奶粉 TBS配制的二抗，室溫 2 h。TBST漂洗10 min×3次后，暗室中 X光膠片上曝光，洗片機(jī)中顯影、洗像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。骨癌痛組與假手術(shù)組 PWT值變化采用秩和檢驗，TNF-α單克隆抗體組第1天 PWT的變化及連續(xù)給藥7 d PWT的變化比較采用單因素方差分析，骨癌痛組與假手術(shù)組、腫瘤對照和TNF-α單克隆抗體組 NaV1.8蛋白表達(dá)比較采用 t檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞接種后及鞘內(nèi)給藥后大鼠痛行為學(xué)的變化

2.1.1 腫瘤細(xì)胞接種后 腫瘤細(xì)胞接種前、接種后第1天和第4天，各組大鼠 PWT值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。接種后第7天，骨癌痛組 PWT值開始下降；接種后第10，14，17天骨癌痛組的PWT值較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.05），且骨癌痛組 PWT隨時間延長降低。見圖1。

圖1 假手術(shù)組與骨癌痛組 PWT比較

2.1.2 鞘內(nèi)給藥后 腫瘤細(xì)胞接種后第11天，單次鞘內(nèi)給予TNF-α單克隆抗體，與0 h相比，PWT值于給藥后0.5 h升高，給藥后2 h達(dá)高峰，6 h仍有統(tǒng)計學(xué)意義，給藥后8 h恢復(fù)到給藥前水平。重復(fù)鞘內(nèi)注射TNF-α單克隆抗體7 d（模擬臨床用藥），TNF-α單克隆抗體組PWT值于給藥后0.5 h升高，2 h達(dá)到高峰，6 h仍有統(tǒng)計學(xué)意義，但 PWT值升高程度較單次給藥降低，給藥后8 h恢復(fù)到給藥前水平。見圖2。

圖2 鞘內(nèi)注射TNF-α單抗不同時間PWT的變化

2.2 NaV1.8的蛋白表達(dá)

2.2.1 腫瘤細(xì)胞接種后 造模后第17天，取假手術(shù)組和骨癌痛組大鼠左側(cè) DRG行蛋白質(zhì)印跡測定，結(jié)果表明骨癌痛組NaV1.8的蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比明顯增高（n=3，t=4.256，P＜0.05）。見圖3。

圖3 假手術(shù)組與骨癌痛組 Nav1.8蛋白的表達(dá)

2.2.2 鞘內(nèi)給藥后 連續(xù)給 TNF-α單克隆抗體 7 d后，取 TNF-α單克隆抗體組和腫瘤對照組大鼠左側(cè) DRG行蛋白質(zhì)印跡測定，結(jié)果顯示，TNF-α單克隆抗體組NaV1.8的蛋白表達(dá)較腫瘤對照組明顯降低（n=4，t=8.827，P＜0.01），見圖4。

圖4 腫瘤對照組與 TNF-α單克隆抗體組Nav1.8蛋白的表達(dá)

3 討論

骨癌痛是癌癥晚期患者最常見的一種癥狀，對癌癥患者的生活質(zhì)量影響顯著。目前，關(guān)于癌性疼痛的機(jī)制還不甚明確，有效的臨床治療手段仍然很有限。因此進(jìn)一步研究骨癌痛的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點顯得極為重要和迫切。已有研究表明，外周敏化在痛覺過敏的發(fā)生中起重要作用，而TNF-α可能是外周痛敏的重要參與者之一［1］。隨著疼痛的形成和發(fā)展，外周局部組織或（和）脊髓水平的TNF-α表達(dá)顯著增多［16］，但其大多基于炎性和神經(jīng)病理性疼痛的研究。高勤等［17］報道小鼠接種癌細(xì)胞后，脊髓水平的TNF-α mRNA的表達(dá)顯著增多，并隨著疼痛的發(fā)展繼續(xù)增加。本研究也證明，骨癌痛模型大鼠鞘內(nèi)注射 TNF-α單克隆抗體后，PWT明顯升高，機(jī)械刺激引起的疼痛癥狀明顯緩解，給藥后2 h達(dá)到高峰；隨著時間的推移，疼痛緩解程度逐漸降低，給藥后8 h恢復(fù)到給藥前水平。實驗結(jié)果提示脊髓水平包括 DRG在內(nèi)的TNF-α可能參與了骨癌痛的發(fā)生。而重復(fù)給藥7 d疼痛緩解仍于給藥后2 h達(dá)高峰，但疼痛緩解程度有所降低，可能與癌痛的進(jìn)展以及藥物耐受有關(guān)。

研究表明 DRG中 TNFR的表達(dá)變化參與了神經(jīng)病理性疼痛［5］。DRG是初級感覺神經(jīng)元胞體所在的位置。TNFR在DRG胞體合成后能夠被運(yùn)送至DRG到脊髓的傳入神經(jīng)纖維的突觸前末端發(fā)揮作用。因此，脊髓中TNF-α既可能作用于突觸后脊髓的TNFR參與骨癌痛的發(fā)生，也可能通過作用于DRG突觸前末端的TNFR參與骨癌痛的發(fā)生。但TNF-α參與骨癌痛的外周機(jī)制并不清楚。

NaV1.8特異性表達(dá)于初級感覺神經(jīng)元的胞體和軸突，介導(dǎo)慢激活慢失活的鈉電流，在外周神經(jīng)的敏化過程中具有重要意義［11，18］。研究表明在炎性疼痛及神經(jīng)病理性痛的狀態(tài)下，NaV1.8在大鼠DRG中的表達(dá)均發(fā)生顯著變化［19］，利用基因敲除選擇性抑制NaV1.8的表達(dá)可明顯降低動物對傷害性刺激的敏感性［20］，提示 NaV1.8可能是痛敏分子機(jī)制的一個靶點。本實驗中骨癌痛組DRG NaV1.8表達(dá)較假手術(shù)組大鼠明顯升高；注射 TNF-α單克隆抗體后，NaV1.8的表達(dá)較腫瘤對照組明顯降低，提示NaV1.8也參與了骨癌痛表達(dá)。在骨癌痛的條件下，DRG中 NaV1.8的表達(dá)增加，在機(jī)械刺激傳來時DRG神經(jīng)元的興奮性增強(qiáng)，誘發(fā)骨癌相關(guān)的機(jī)械痛覺過敏，而當(dāng)TNF-α的作用被阻斷后，DRG NaV1.8的表達(dá)下降，DRG神經(jīng)元受到刺激后的興奮性下降，骨癌痛癥狀得到緩解。

綜上所述，在晚期骨癌痛模型中大鼠 PWT降低，DRG神經(jīng)元上的 NaV1.8表達(dá)增加，TNF-α單克隆抗體可能通過抑制DRG神經(jīng)元上的NaV1.8的表達(dá)改善其機(jī)械性刺激痛敏。本研究的意義在于揭示了骨癌痛的一種外周機(jī)制，為骨癌痛的緩解治療提供了一個新的潛在的方法。

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Intrathecal injection of TNF-α antibodies attenuates bone cancer pain in rats

LU Xiang-rong1，WANG Feng1，WEI Jing-rong2，ZHOU You-lang2，MIAO Xiu-hua3，XIAO Ying2，XU Wei-yuan3
（1.Department of Hand Surgery，Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300；2.Institute of Neuroscience，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123；3.Department of Orthopedics，Zhangjiagang First People′s Hospital Affiliated to Soochow University，Zhangjiagang Jiangsu 215600，China）

R738.1

A

1671-7783（2015）01-0033-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140300

陸向榮（1978—），男，碩士研究生；徐為袁（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail:xwy143@163.com

2014-12-04 ［編輯］何承志