藥渣纖維素降解菌的篩選及酶活測定

郭建軍等

摘要：以藥渣和羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源，通過平板初篩及多種酶活綜合測定復(fù)篩，從深層封土、牛糞堆肥等樣品中篩選到８株纖維素降解菌，其中菌株ＪＸ９的酶活最高，酶系組成最合理，其Ｃｘ、Ｃｂ、Ｃ１和ＦＰＡ分別達(dá)到８２．４１、5.71、15.52和7.64 Ｕ／ｍＬ。

關(guān)鍵詞：藥渣；纖維素降解菌；篩選；纖維素酶

中圖分類號(hào)：Ｑ９３－３３１；Ｑ９４６．５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）04－0689-03

江西省現(xiàn)有中成藥生產(chǎn)企業(yè)近百家，這些企業(yè)每年產(chǎn)生近１００萬ｔ廢棄中藥渣，而全國每年產(chǎn)生１ ０００多萬ｔ中藥殘?jiān)郏保?。藥渣造成大量環(huán)境污染的同時(shí)也增加了企業(yè)處理這些藥渣的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，如何有效處理這些藥渣的問題已日益突出［２］。藥渣主要組分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中纖維素是制約藥渣降解的重要因素。使用傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法，如酸處理、堿處理以及蒸汽加熱等方法處理藥渣等，存在反應(yīng)條件劇烈、設(shè)備昂貴、成本較高、帶來新的環(huán)境污染等問題［１－３］。而利用投加纖維素高效降解菌的方法經(jīng)濟(jì)、有效，正逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［４］。近年來，國內(nèi)外對于纖維素降解菌和纖維素酶的報(bào)道較多，但大部分研究集中在對秸稈的降解上，對于藥渣降解的報(bào)道甚少。本研究的目的就是利用以纖維素為惟一碳源的方法從堆肥中初步篩選高效無毒的好氧纖維素降解菌，再從中復(fù)篩出較好的菌株，以便開發(fā)藥渣好氧堆肥的高效微生物菌劑。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１含菌樣品２００９年１０月中旬，采集森林中腐化的楠木、長期堆放而腐化的松木以及腐爛的植物下表層濕潤肥沃的土壤，采集長期堆放藥渣被污染的表層肥沃的土壤以及深層封土、牛糞堆肥等共１０份樣品。這１０份樣品包括植物樣品４份、土壤樣品６份。采集樣品后立即帶回實(shí)驗(yàn)室接種，進(jìn)行富集培養(yǎng)。

１．１．２培養(yǎng)基［５］富集培養(yǎng)基：Ｋ２ＨＰＯ４ ２．０ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．４ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．３ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ５．０ ｍｇ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ １．６ ｍｇ，ＺｎＳＯ４ １．７ ｍｇ，ＣｏＣｌ２ ２．０ ｍｇ，藥渣粉３０ ｇ，用去離子水定容至１ Ｌ。羧甲基纖維素鈉（ＣＭＣ-Na）固體培養(yǎng)基：ＣＭＣ－Ｎａ １５．０ ｇ，ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ ｇ，瓊脂２０ ｇ，用去離子水定容至１ Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃滅菌。纖維素－剛果紅固體培養(yǎng)基：ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ ｇ，瓊脂２０ ｇ，剛果紅０．２ ｇ，ＣＭＣ－Ｎａ ２０ ｇ，ＮａＣｌ ０．５ ｇ，用去離子水定容至１ Ｌ，ｐＨ自然，１２１℃滅菌。液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：ＣＭＣ－Ｎａ或者藥渣２６ ｇ，ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，蛋白胨１ ｇ，酵母膏１ ｇ，ｐＨ ７．０～７．５，１２１ ℃滅菌。

１．２方法

１．２．１菌種富集稱取菌種來源樣品５ ｇ，加入以藥渣為惟一碳源的１００ ｍＬ富集培養(yǎng)基中，２８ ℃恒溫振蕩培養(yǎng)７ ｄ，吸取５ ｍＬ培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的富集培養(yǎng)基，富集３代。

１．２．２菌種初篩取富集３代的培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋，在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上分離純化菌種，觀察平皿上是否出現(xiàn)水解環(huán)以及水解環(huán)的大小。同時(shí)參考水解環(huán)產(chǎn)生的先后和清晰度，初步比較不同菌株的纖維素酶酶活，并確定用于酶活測定的菌株。

１．２．３菌種復(fù)篩將分離得到的優(yōu)勢菌株分別接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，３７ ℃振蕩培養(yǎng)４ ｄ，將發(fā)酵液用2層紗布過濾，濾液于４ ℃，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，上清液即為粗酶液。

１．２．４酶活測定［６，７］采用ＤＮＳ還原糖法測定各纖維素酶酶活。全酶活（ＦＰＡ）的測定：取2支２５ ｍＬ刻度的試管，各加０．２ ｍＬ酶液，再加ｐＨ ４．８的醋酸緩沖液１．８ ｍＬ。測定管加入１ ｃｍ × ６ ｃｍ濾紙條，充分浸泡于（５０.0±０．５）℃恒溫水?。叮?ｍｉｎ，空白管同時(shí)置（５０.0±０．５）℃恒溫水?。叮?ｍｉｎ。然后分別加入ＤＮＳ顯色液２ ｍＬ，空白管同時(shí)加１ ｃｍ × ６ ｃｍ濾紙條。沸水?。保?ｍｉｎ，冷卻后加水至１５ ｍＬ，以空白管調(diào)零點(diǎn)，在５５０ ｎｍ處測ＯＤ值。內(nèi)切酶酶活（Ｃｘ）的測定：取2支２５ ｍＬ刻度的試管，各加０．２ ｍＬ酶液。測定管加１．８ ｍＬ ＣＭＣ-Na（質(zhì)量分?jǐn)?shù)１％），空白管只加ｐＨ ４．８的醋酸緩沖液１．８ ｍＬ。然后置（５０.0±０．５）℃恒溫水浴６０ ｍｉｎ。再分別加入ＤＮＳ顯色液２ ｍＬ。放沸水浴鍋反應(yīng)１０ ｍｉｎ，冷卻后加水至１５ ｍＬ，以空白管調(diào)零點(diǎn)，在５５０ ｎｍ處測ＯＤ值。外切酶酶活（Ｃ１）測定則只用把ＦＰＡ測定中的濾紙條換成５０ ｍｇ的脫脂棉，β－葡萄糖苷酶酶活（Ｃｂ）測定需把Ｃｘ測定中的ＣＭＣ-Na（質(zhì)量分?jǐn)?shù)１％）換成水楊素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)１％）。

２結(jié)果與分析

２．１菌種初篩結(jié)果

將來自于堆放的腐化朽木、腐爛植物及腐爛藥渣的肥沃土壤及深層封土等作樣品，在以藥渣為惟一碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行３代富集，取其菌液涂布于ＣＭＣ-Na固體培養(yǎng)基中，待其長出菌落后，進(jìn)行平板劃線法分離，分離到一系列纖維素降解菌。然后將分離得到的纖維素降解菌分別接種在纖維素－剛果紅固體培養(yǎng)基上觀察其生長情況。纖維素降解菌能快速地在纖維素－剛果紅固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生清亮的水解環(huán)，試驗(yàn)表明，其中JX8和ＪＸ９菌株在平板上能較快地產(chǎn)生較大的水解環(huán)，圖１是ＪＸ８和ＪＸ９在培養(yǎng)基上的水解環(huán)，說明它們具有較高的纖維素酶酶活。

２．２菌種復(fù)篩結(jié)果

纖維素的降解是多酶體系作用的結(jié)果，多酶體系包括內(nèi)切β-1，4葡萄糖苷酶（Ｃｘ酶）、外切β-1，4葡萄糖苷酶（Ｃ１酶）、β－糖苷酶（Ｃｂ酶）３種主要成分。為此選擇測定Ｃｘ、Ｃ１、Ｃｂ、ＦＰＡ ４種酶活大小作為菌種的復(fù)篩依據(jù)。

將菌種分別接入以藥渣和ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)５ ｄ后的酶活測定結(jié)果如表１所示。通過對以藥渣和ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的兩種發(fā)酵方式進(jìn)行酶活測定，篩選得到了８株酶系組成各異的菌株。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，對于FPA和Ｃｘ，以藥渣為碳源的菌ＪＸ９和以ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的菌ＪＸ８的較高，且它們的Ｃｘ與其他菌相比差異較大；對于Ｃ１，以藥渣為碳源的菌ＳＣ１和以ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的菌ＳＣ３的較高；Ｃｂ相對于其他酶活都較低；Ｃ１、Ｃｂ和FPA在菌株之間差異都較小；這些表明菌株ＪＸ８和ＪＸ９降解纖維素的能力比其他菌株要強(qiáng)；酶活測定結(jié)果與水解環(huán)測定結(jié)果基本吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了用纖維素－剛果紅固體培養(yǎng)基平板篩選纖維素降解菌的方法是比較合理可行的。

２．３纖維素降解菌產(chǎn)酶的酶活穩(wěn)定性測定結(jié)果

由上述試驗(yàn)可以看出，菌株ＪＸ８和ＪＸ９的酶活相對較高，說明其分解藥渣、ＣＭＣ－Ｎａ的能力比其他菌株要強(qiáng)，因此，選擇以藥渣為碳源的ＪＸ９菌株和以ＣＭＣ－Ｎａ為碳源的ＪＸ８菌株的發(fā)酵液為試驗(yàn)樣。在２０～１００ ℃的不同溫度下測定其Ｃｘ，如圖２所示，兩菌株產(chǎn)酶的酶活具有較好的耐高溫活性，但菌株ＪＸ９的Ｃｘ一直高于ＪＸ8；圖３結(jié)果表明，ＪＸ９菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活在ｐＨ ４～９時(shí)都保持較高的活性，相對ＪＸ8更穩(wěn)定，說明其發(fā)酵后產(chǎn)生的酶活具有較好的廣譜性，該試驗(yàn)說明菌株JX9相對JX8酶活更高且酶系組成更合理。

３結(jié)論與討論

為了獲得盡可能多的優(yōu)良降解菌，一般采用多種方法對纖維素降解菌進(jìn)行篩選。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)纖維素－剛果紅培養(yǎng)基平板法進(jìn)行初篩和多種纖維素酶活綜合測定進(jìn)行復(fù)篩相結(jié)合，以防止遺漏優(yōu)良菌種［８］。篩選得到了８株酶活較高且酶系組成比較合理的菌種，其中ＪＸ９菌的酶活最好，酶系組成也最合理，對其以藥渣為碳源的發(fā)酵，F(xiàn)PA達(dá)7.64 Ｕ／ｍＬ，Ｃx、Ｃｂ和Ｃ１分別為82.41、5.71和15.52 Ｕ／ｍＬ，且其酶活穩(wěn)定性相對較高，說明了纖維素的降解是多酶體系協(xié)同作用的結(jié)果，以多種酶指標(biāo)進(jìn)行纖維素降解菌的篩選是一種更為有效的篩選方法。

纖維素的生物降解過程涉及到一組復(fù)合的纖維素酶，一般認(rèn)為它包括３種，分別為內(nèi)切β－１，４葡萄糖苷酶，簡稱內(nèi)切酶；外切β－１，４葡萄糖苷酶，簡稱外切酶；β－糖苷酶，也稱纖維二糖酶。纖維素的降解必須依靠３種組分的協(xié)同作用才能完成［９］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株ＪＸ９內(nèi)切酶酶活高，且穩(wěn)定性較好，但Ｃ1不如Ｃｘ好。研究表明，內(nèi)切酶對聚合度高的長鏈纖維素水解能力強(qiáng)，而β－糖苷酶對短鏈纖維素類物質(zhì)如纖維二糖具有很強(qiáng)的水解能力［１０，１１］，Ｃb過低會(huì)導(dǎo)致中間產(chǎn)物纖維二糖積累從而阻遏或抑制整個(gè)纖維素降解過程［１２，１３］。因此今后的工作中，可篩選Ｃb較高的菌株與ＪＸ９混合發(fā)酵，進(jìn)一步提高ＪＸ９降解纖維素的效率。

今后可以結(jié)合藥渣降解，進(jìn)一步加強(qiáng)微生物參與利用纖維素降解生產(chǎn)，這對緩解能源危機(jī)及環(huán)境污染等問題也具有深遠(yuǎn)的影響。近年來許多學(xué)者認(rèn)為，纖維素的高效降解與微生物之間的協(xié)同作用有一定相關(guān)性，這些協(xié)同作用包括纖維素降解菌間、纖維素和非纖維素降解菌間的相互作用。張曉昱等［１４］研究發(fā)現(xiàn)把真菌與細(xì)菌共培養(yǎng)后，其降解纖維素的速率明顯高于任何一個(gè)單一菌株。但是由于菌種的產(chǎn)酶能力以及酶組分比例協(xié)調(diào)問題，在纖維素高效降解過程中，多種微生物之間的協(xié)同降解仍有待進(jìn)一步研究。