內(nèi)生固氮菌HAUM10對(duì)水稻的侵染定殖規(guī)律及促生效應(yīng)

陶艷會(huì) 林會(huì) 趙斌

摘要：試驗(yàn)以從表面滅菌的稗草中分離到的一株內(nèi)生固氮菌ＨＡＵＭ１０為對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)該菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)固氮酶和吲哚乙酸能力。乙炔還原法測(cè)定其所產(chǎn)固氮酶的活性為０．８２４ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｍＬ·ｈ），液相色譜法測(cè)定其產(chǎn)吲哚乙酸量為１５．４４ μｇ／ｍＬ。將ＨＡＵＭ１０用ｇｆｐ基因標(biāo)記后接種水稻，觀察其在水稻中的侵染定殖規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在接種后第7天，ｇｆｐ標(biāo)記的ＨＡＵＭ１０主要定殖于根內(nèi)通氣組織和韌皮部細(xì)胞，少量定殖在葉鞘中。盆栽試驗(yàn)表明，ＨＡＵＭ１０促進(jìn)水稻葉綠素合成，有利于光合作用，在水稻生長(zhǎng)后期促進(jìn)氮、磷元素由葉向穗轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生固氮菌；水稻；侵染；定殖；促生

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ１５４．３８＋１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）06－1257-06

Infection and Colonization of Endophytic Diazotroph HAUM10 on Rice Seedlings

and Its Plant Growth-Promoting Role

ＴＡＯ Ｙａｎ－ｈｕｉ，ＬＩＮ Ｈｕｉ，ＺＨＡＯ Ｂｉｎ

（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Aｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ ＨＡＵＭ１０ ｗａｓ ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｕｒｆａｃｅ－ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｃｒｕｓｇａｌｌｉ and it ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＩＡＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ． Ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＡＲＡ） ｗａｓ ａｂｏｕｔ ０．８２４ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｍＬ·ｈ）． Ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ determine the ＩＡＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＡＵＭ１０ which was detected as ｕｐ ｔｏ １５．４４ μｇ/ｍL． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｂｙ ｇｆｐ－ｔａｇｇｅｄ ＨＡＵＭ１０ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ． ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ ｗａｓ ｍａｉｎｌｙ ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ａｅｒｅｎｃｈｙｍａ ａｎｄ ｐｈｌｏｅｍ ａｔ the 7th day ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ； While a few was ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｓｈｅａｔｈ． Ｐｏｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＨＡＵＭ１０ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ the ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｆｒｏｍ ｌｅａｆ ｔｏ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｒｉｃｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ； ｒｉｃｅ； ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ； ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ； ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ

水稻生長(zhǎng)過(guò)程除了需要大量的水外，氮源是其最重要的生長(zhǎng)因子。中國(guó)是世界上稻米的主要生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)之一，目前化肥是實(shí)現(xiàn)單位面積高產(chǎn)的重要因素之一，但中國(guó)占世界約７％的耕地面積中施用的氮肥高達(dá)全球氮肥總用量的３５％以上［１］。氮肥進(jìn)入灌溉稻田后，通過(guò)氨的揮發(fā)、硝化－反硝化作用、表面流失等多途徑損失，最終導(dǎo)致氮肥利用率降低。大量氮素?fù)p失導(dǎo)致一系列環(huán)境問(wèn)題：地下水污染和江河湖泊的富營(yíng)養(yǎng)化；飲用水中硝酸鹽濃度高于１０ ｍｇ／Ｌ將導(dǎo)致嬰兒高鐵血紅蛋白癥和成人胃癌；Ｎ２Ｏ和ＮＯ的排放可能導(dǎo)致全球氣候變暖［２］。生物固氮不僅可以為植物提供氮源緩解施用化肥帶來(lái)的一系列危害，而且具有環(huán)保、高效、節(jié)能、高效等優(yōu)點(diǎn)，因此研究利用生物固氮的方式為水稻提供氮源具有極其重要的意義。

植物內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物，被感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在癥狀，可通過(guò)組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物ＤＮＡ的方法來(lái)證明其內(nèi)生性［３］。內(nèi)生菌對(duì)宿主植物的促生效應(yīng)包括固氮、解磷、分泌植物激素、促進(jìn)礦質(zhì)元素吸收、生物防治等［４］。植物內(nèi)生固氮菌（Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ）是一類(lèi)能定殖在健康植物體內(nèi)，與宿主植物進(jìn)行聯(lián)合固氮的微生物。由于內(nèi)生固氮菌在農(nóng)作物體內(nèi)不僅具有固氮活性，而且可能分泌植物激素等多種生物活性物質(zhì)促進(jìn)作物生長(zhǎng)，因此，利用內(nèi)生固氮菌對(duì)植物的促生效應(yīng)，有可能開(kāi)辟一條不同于根瘤菌與豆科作物互作促生的途徑。考慮到與水稻生長(zhǎng)環(huán)境相似、常與水稻發(fā)生營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的稗草中可能存在某些有促生作用的內(nèi)生固氮菌，故將稗草作為內(nèi)生固氮菌分離的材料，研究了其中一株內(nèi)生固氮菌在水稻中的侵染定殖規(guī)律及對(duì)水稻的促生效應(yīng)。

１材料與方法

１．１材料

內(nèi)生固氮菌來(lái)源：ＨＡＵＭ１０由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地的稻田溝渠稗草中分離得到。ＨＡＵＭ１０單個(gè)菌體短桿狀，不形成芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏陰性。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)，單個(gè)菌落平滑，菌落淡黃色，半透明，中間凸起，粘著于培養(yǎng)基上；在無(wú)氮阿須貝氏培養(yǎng)基平板上，菌落透明黏稠，邊緣不規(guī)則向周?chē)鷶U(kuò)展生長(zhǎng)。根據(jù)ＨＡＵＭ１０的生理生化性質(zhì)和１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列比對(duì)結(jié)果，鑒定ＨＡＵＭ１０是一株泛菌（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）。

含ｇｆｐ基因的供體菌：大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）ｃｃｌｌ８λ／ｐＦＡＪ１８２０，卡那霉素抗性［５］。由比利時(shí)魯汶大學(xué)Ｊ． Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ教授饋贈(zèng)。

三親本雜交輔助菌：Ｅ． ｃｏｌｉ（ｐＰＫ２０７３，Ｓｐｅ Ｒ）。

１．２方法

１．２．１擴(kuò)增固氮酶ｎｉｆＨ基因，測(cè)定固氮酶活性首先用堿變性法［６］抽提HAUM10總ＤＮＡ，并稀釋100倍后作為模板。固氮酶ｎｉｆＨ基因擴(kuò)增引物和反應(yīng)程序參考Ｕｅｄａ等［７］的方法。ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用ＤＮＡ純化試劑盒回收，回收產(chǎn)物連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，轉(zhuǎn)化入ＤＨ５α，挑陽(yáng)性克隆測(cè)序。

乙炔還原法測(cè)純培養(yǎng)的內(nèi)生固氮菌所產(chǎn)固氮酶活性［６］。將改良的Ｄｏ氏培養(yǎng)基［８］３ ｍＬ分裝于ＰＡ瓶中滅菌后制成斜面，取等量?jī)?nèi)生固氮菌接種于Ｄｏ氏培養(yǎng)基，２８ ℃培養(yǎng)４８ ｈ后將ＰＡ瓶上的硅膠蓋換成不透氣的橡膠塞。用注射器平衡瓶?jī)?nèi)外壓力后，抽出１０％體積的空氣，注入等體積的乙炔，繼續(xù)在２８ ℃下培養(yǎng)２４ ｈ。氣相色譜儀測(cè)定乙烯生成量。

１．２．２產(chǎn)吲哚乙酸試驗(yàn)ＣＣＭ培養(yǎng)基［９］：葡萄糖５ ｇ，甘露糖５ ｇ，蘋(píng)果酸５ ｇ，ＮＨ４Ｃｌ １ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ５．８，加色氨酸０．２ ｇ／Ｌ。接種菌體于ＣＣＭ培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)１周；１０ ０００ ｇ離心１５ ｍｉｎ，收集上清液；ＨＣｌ調(diào)節(jié)上清液ｐＨ為２．８；用等體積的乙酸乙酯抽提3遍；提取物４０ ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮至近干，然后加１ ｍＬ無(wú)水乙醇懸?。唬龋校蹋脵z測(cè)：采用Ｃ１８色譜柱，Ｖ甲醇∶Ｖ醋酸∶Ｖ水＝３０∶１∶７０為流動(dòng)相，流速１．２ ｍＬ／ｍｉｎ，λＩＡＡ＝２８０ ｎｍ［１０］。

１．２．３ｇｆｐ基因標(biāo)記ＨＡＵＭ１０及接合子的鑒定以抗生素利福平作為三親本雜交試驗(yàn)受體菌的篩選標(biāo)記，馴化ＨＡＵＭ１０，得到抗１００ μｇ／ｍＬ Ｒｉｆ的ＨＡＵＭ１０。

三親本雜交方法參考趙斌等［６］的方法。為了得到穩(wěn)定表達(dá)的ｇｆｐ接合子，將三抗平板上得到的接合子菌體在無(wú)抗性的液體ＬＢ培養(yǎng)基中傳20代，然后將菌液稀釋?zhuān)保埃繁锻咳梗ǎ遥椋?１００ μｇ／ｍＬ，Ｓｐｅ ５０ μｇ／ｍＬ，Ｋｍ ３０ μｇ／ｍＬ）ＬＢ平板，即可得到較為穩(wěn)定的ｇｆｐ接合子。

鑒定轉(zhuǎn)化子：在熒光顯微鏡下觀察菌體是否發(fā)出綠色熒光，是否在三抗阿須貝氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；ＰＣＲ擴(kuò)增菌體ｇｆｐ基因：挑轉(zhuǎn)化子于三抗ＬＢ培養(yǎng)基生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，取菌液３０ μＬ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１ ｍｉｎ，倒掉上清液加入５０ μＬ無(wú)菌去離子水并搖動(dòng)均勻，１００ ℃、５ ｍｉｎ后置冰上５ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，?。?μＬ上清液作為模板。ｇｆｐ引物的設(shè)計(jì)：從ＧｅｎＢａｎｋ中搜索到ｇｆｐ基因的序列，根據(jù)ｇｆｐ基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物。Ｇｆｐｆ為５′－ＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＡＣＡ

ＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣ－３′，Ｇｆｐｒ?yàn)椋怠洌茫茫粒粒牵茫裕裕牵茫粒裕牵茫茫裕牵茫粒牵牵裕茫场?。反?yīng)體系（２０ μＬ）：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ；ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ和ｄＧＴＰ濃度均為２ ｍｍｏｌ／Ｌ）２ μＬ；正反向引物（５０ μｇ／ｍＬ）各０．８ μＬ；模板ＤＮＡ（１０ ｎｇ/mL）１ μＬ；Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ；加水至２０ μＬ。反應(yīng)程序：９４ ℃，預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５７ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０個(gè)循環(huán)；７２ ℃繼續(xù)延伸１０ ｍｉｎ。

１．２．４ＨＡＵＭ１０在水稻中的侵染定植路徑水稻（中花１１）種子表面滅菌處理參考文獻(xiàn)［１０］的方法。將滅菌后的水稻種子鋪于１％瓊脂固體培養(yǎng)基中萌發(fā)５ ｄ，選擇健壯的幼苗剪少許根后移入２０ ｍＬ裝有水稻無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液配置的半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度３．２５ ｇ／Ｌ）的玻璃試管（口徑２．５ ｃｍ，長(zhǎng)１９ ｃｍ）中。接入無(wú)菌水懸浮的ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ。管底作避光處理后，置智能光照培養(yǎng)箱（光照２７ ℃，１６ ｈ/d；黑暗２５ ℃，８ ｈ/d）培養(yǎng)。

于接種后３、５、７ ｄ分別取水稻幼苗，無(wú)菌水洗去表面附著菌體。在連續(xù)變倍體式顯微鏡下用不銹鋼刀片切取水稻組織制作切片。激光掃描共聚焦顯微鏡λ４８８ｎｍ激發(fā)光下觀察水稻各部位內(nèi)生固氮菌存在狀態(tài)。

１．２．５ＨＡＵＭ１０纖維素酶和果膠酶試驗(yàn)纖維素酶試驗(yàn)采用趙斌等［６］的纖維素水解試驗(yàn)方法一。配制果膠培養(yǎng)基［６］，０．１ ＭＰａ滅菌５ ｍｉｎ倒平板，每個(gè)平板點(diǎn)種４株菌株，２８ ℃倒置培養(yǎng)２～４ ｄ。

１．２．６盆栽試驗(yàn)觀察ＨＡＵＭ１０對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響盆栽試驗(yàn)設(shè)不接種（ＣＫ）和接種ＨＡＵＭ１０兩種處理，各４個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)１盆（盆口徑２０．５ ｃｍ，高１９.0 ｃｍ，土深１４.0 ｃｍ）。水稻種子表面滅菌后，置于添加無(wú)菌水的平皿中，２８ ℃萌發(fā)５ ｄ后，倒掉無(wú)菌水，加入無(wú)菌水懸浮的菌液浸苗過(guò)夜。每盆２５棵苗，等距種植。水稻生長(zhǎng)過(guò)程澆自來(lái)水和無(wú)氮Ｆａｈｒａｅｕｓ營(yíng)養(yǎng)液。待水稻生長(zhǎng)至分蘗期和灌漿期再各接種一次內(nèi)生固氮菌劑。移栽后分別在第７、１４、２１、３０、４５天取樣，將植株完全拔出后自來(lái)水沖洗干凈。觀察內(nèi)生固氮菌在水稻不同部位的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，不同時(shí)期測(cè)ＨＡＵＭ１０在水稻體內(nèi)的固氮酶活性［１０］。移栽后第４５天取水稻苗測(cè)葉片的葉綠素含量［１１］。第４５天和種子收獲期取樣消化［１２］后以凱氏定氮法和鉬銻抗比色法分別測(cè)水稻氮和磷含量。

２結(jié)果與分析

２．１ＨＡＵＭ１０固氮酶基因ｎｉｆＨ及固氮酶活性

ｎｉｆＨ基因是蛋白酶多肽的３個(gè)功能基因ｎｉｆＨＤＫ之一，擴(kuò)增片段大小為３９０ ｂｐ（圖１）。測(cè)序結(jié)果在ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)ＢＬＡＳＴ比對(duì)，與成團(tuán)泛菌（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）的ｎｉｆＨ序列覆蓋率為７５％，同一性為９６％。乙炔還原法測(cè)定ＨＡＵＭ１０的固氮酶活性為０．８２４ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｍＬ·ｈ）。

２．２產(chǎn)吲哚乙酸試驗(yàn)結(jié)果分析

高效液相色譜法測(cè)定吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間是１１．０２０ ｍｉｎ（圖２ａ），確定ＨＡＵＭ１０發(fā)酵液出峰時(shí)間為１１．１７３ ｍｉｎ的峰圖是其所產(chǎn)吲哚乙酸的峰圖（圖２ｂ），可得ＨＡＵＭ１０產(chǎn)吲哚乙酸量為１５．４４ μｇ／ｍＬ。

２．３ｇｆｐ標(biāo)記菌株的鑒定

ＨＡＵＭ１０與供體菌、輔助菌接合后，在選擇性三抗培養(yǎng)基上產(chǎn)生了一些接合子，而單獨(dú)的供體菌、輔助菌、受體菌在這樣的選擇性培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)。將其接種于無(wú)氮三抗培養(yǎng)基上，接合子可生長(zhǎng)，單獨(dú)的供體菌、輔助菌、受體菌不生長(zhǎng)。用無(wú)選擇壓力的液體ＬＢ培養(yǎng)基傳20代后，在三抗ＬＢ培養(yǎng)基上篩選穩(wěn)定的接合子，此時(shí)在ＺＥＩＳＳ熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光下明顯看到每個(gè)單菌落發(fā)出明亮的熒光。挑?。纾妫鸱€(wěn)定表達(dá)的接合子單菌落液體培養(yǎng)后取菌液，ＰＣＲ擴(kuò)增ｇｆｐ片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖３。從圖3可以看出，經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增后，ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ和陽(yáng)性對(duì)照Ｅ． ｃｏｌｉ ｃｃｌｌ８λ／ｐＦＡＪ１８２０都產(chǎn)生了分子量相同的惟一一條電泳帶（片段大小約７９０ ｂｐ），而野生型的ＨＡＵＭ１０未產(chǎn)生任何條帶。

２．４ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ在水稻中的侵染定殖

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水稻苗接菌后，在水稻根周?chē)薄?ｍｍ內(nèi)可見(jiàn)云霧狀細(xì)菌群圍繞，說(shuō)明HAUM10主要通過(guò)根部侵染進(jìn)入稻體，而在未接菌的水稻根的周?chē)鷽](méi)有此現(xiàn)象。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察未接菌對(duì)照的水稻根，橫切面內(nèi)沒(méi)有綠色熒光標(biāo)記的菌體侵染定殖（圖４ａ）。接種后第3天，用普通熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)水稻根毛區(qū)聚集大量?jī)?nèi)生固氮菌，附著于根表面（圖４ｂ）。第5天，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)水稻表皮細(xì)胞和皮層細(xì)胞有少量ｇｆｐ標(biāo)記的ＨＡＵＭ１０。第7天，根內(nèi)ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ數(shù)量增多，內(nèi)生固氮菌主要分布于皮層細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞，當(dāng)薄壁細(xì)胞萎縮徑向壁相互重疊形成通氣腔后，在通氣組織中可看到HAUM10－ｇｆｐ（圖４ｃ）；在葉鞘橫切面和縱切面也可見(jiàn)較多的ＨＡＵＭ１０－ｇｆｐ，主要存在于韌皮部細(xì)胞和薄壁組織中（圖４ｄ和圖４ｅ）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在維管束中有極少量ｇｆｐ基因標(biāo)記的菌體。

２．５ＨＡＵＭ１０所產(chǎn)纖維素酶和果膠酶的活性

接種兩周后觀察ＨＡＵＭ１０分解纖維素的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)接種ＨＡＵＭ１０的濾紙條比未接菌對(duì)照濾紙條變薄。根據(jù)纖維素分解菌具有將纖維濾紙分解使其失去原有物理性狀的性質(zhì)，說(shuō)明它可以產(chǎn)生纖維素酶分解纖維素。ＨＡＵＭ１０在果膠培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，在菌體生長(zhǎng)區(qū)域培養(yǎng)基顏色由黃色變?yōu)樗{(lán)色（培養(yǎng)基中添加了酸堿指示劑），且菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基出現(xiàn)下凹（圖５）。根據(jù)果膠可以使液體培養(yǎng)基胨化，果膠被分解，胨狀培養(yǎng)基被液化，培養(yǎng)基表面會(huì)出現(xiàn)下凹的原理，說(shuō)明ＨＡＵＭ１０在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠分泌果膠酶。

２．６盆栽試驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)盆栽試驗(yàn)，觀察ＨＡＵＭ１０在水稻不同部位的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，在接種后第7天水稻根、莖、葉內(nèi)都已經(jīng)有HAUM10侵染定殖。接種后第7天時(shí)，水稻鮮根、莖、葉菌體數(shù)量分別為１０８、１０６、１０３ ＣＦＵ／ｇ；第１４天，水稻鮮根、莖、葉菌體數(shù)量分別是１０７、１０６、１０３ ＣＦＵ／ｇ；第２１天，水稻鮮根、莖、葉菌體數(shù)量分別是１０５、１０４、１０２ ＣＦＵ／ｇ，第３０天，水稻鮮根、莖、葉菌體數(shù)量分別是１０３、１０２、１０ ＣＦＵ／ｇ。ＨＡＵＭ１０在水稻體內(nèi)遷移路徑是從根到莖再到葉，菌量表現(xiàn)為根＞莖＞葉。第7天測(cè)得ＨＡＵＭ１０在水稻鮮根的固氮酶活性為５．６７４ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ·ｈ），第１４天為４．８３７ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ·ｈ），第２１天為０．９１ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ·ｈ），第３０天為０．３０１ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ·ｈ），第４５天為０．１３２ μｍｏｌ Ｃ２Ｈ４／（ｇ·ｈ）。接種ＨＡＵＭ１０第４５天后水稻鮮葉葉綠素ａ含量和總?cè)~綠素含量分別為２．８６８和４．１４３ ｍｇ／ｇ，分別比對(duì)照增長(zhǎng)５１．９％和１９．１５％；地上部分、地下部分全氮含量分別為１１７．６０、５２．３４ ｇ／ｋｇ，分別比對(duì)照增長(zhǎng)２９．３９％、４８．８６％，全磷含量分別為１９．１８、１０．３１ ｇ／ｋｇ，分別比對(duì)照增長(zhǎng)３０．１２％、１２．４３％；收獲期水稻葉片接種ＨＡＵＭ１０的全氮、全磷含量分別為１２９．６０、８．５０ ｇ／ｋｇ，分別比對(duì)照下降２６．８２％、１５．１７％（表１）。

３討論

內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)黏附作用吸附在植物細(xì)胞的表面，這對(duì)細(xì)菌侵染定殖有很好的促進(jìn)作用。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水稻根毛區(qū)聚集較多的ＨＡＵＭ１０，附著于根上。大多數(shù)內(nèi)生菌都具有分解纖維素和果膠的能力，有助于其穿透植物細(xì)胞壁，進(jìn)入植物體內(nèi)部［１３］。同樣，對(duì)ＨＡＵＭ１０進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)其果膠分解能力比較強(qiáng)。運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)說(shuō)明ＨＡＵＭ１０可能具有鞭毛，這有利于其發(fā)揮主動(dòng)運(yùn)動(dòng)性，向有利于其生存的環(huán)境移動(dòng)，同時(shí)可以開(kāi)辟更廣闊的生存空間。顯微切片發(fā)現(xiàn)ＨＡＵＭ１０主要定殖于根和葉鞘的皮層細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞，可能這些部位細(xì)胞有利于其生存。Ｇｙａｎｅｓｈｗａｒ等［１４］利用免疫金標(biāo)記技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，固氮型內(nèi)生菌粘質(zhì)沙雷氏菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）可以定殖于水稻根、莖、葉中，在細(xì)胞間隙、衰老根的皮層細(xì)胞、通氣組織和木質(zhì)部導(dǎo)管中有大量該菌定殖。Ｊｈａ等［１５］利用ｇｕｓＡ標(biāo)記克雷伯氏產(chǎn)酸菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ＧＲ－３，通過(guò)組織染色發(fā)現(xiàn)新生側(cè)根處極有可能是該菌侵染進(jìn)入水稻根內(nèi)的主要部位。

高效液相色譜法分析ＨＡＵＭ１０產(chǎn)吲哚乙酸的情況，由色譜圖可知ＨＡＵＭ１０能分泌吲哚乙酸，而且還有其他許多未知物質(zhì)產(chǎn)生，某些物質(zhì)的分泌量比吲哚乙酸多。這些未知物質(zhì)可能是其他植物激素，對(duì)宿主植物有促生作用或有助于植物進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽運(yùn)輸、營(yíng)養(yǎng)分配等。ＨＡＵＭ１０可分泌生長(zhǎng)激素，可能在植物體內(nèi)也通過(guò)分泌植物激素的方式對(duì)宿主起促生作用。ＩＡＡ可促進(jìn)水稻根的伸長(zhǎng)，增加根系與土壤接觸面積，從而有利于吸收環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如礦質(zhì)元素和水，最終增加植物的生物量［１５］。Ｍａｔｔｏｓ等［１６］用Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ接種水稻，認(rèn)為Ｂ． ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ可產(chǎn)生吲哚乙酸，使植株側(cè)根和根毛增多。

盆栽試驗(yàn)是在水稻種子萌發(fā)５ ｄ后接種ＨＡＵＭ１０，是因?yàn)樵诿劝l(fā)時(shí)接種有助于該菌充分與水稻根接觸，達(dá)到促根目的，使根系強(qiáng)大，為培育壯秧打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)；另外，有助于該菌占領(lǐng)根系，排除盆栽外環(huán)境中其他雜菌的干擾［１７］。對(duì)收獲期水稻葉中氮、磷含量分析發(fā)現(xiàn)，接種ＨＡＵＭ１０的水稻葉中氮、磷含量均比未接菌水稻葉中氮、磷含量低，分析可能是ＨＡＵＭ１０在水稻生長(zhǎng)后期對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由葉運(yùn)輸至穗發(fā)揮了一定的作用。沈德龍等［１８］利用１４Ｃ同位素標(biāo)記技術(shù)研究了水稻內(nèi)生成團(tuán)泛菌ＹＳ１９在水稻子粒乳熟初期和乳熟后期對(duì)光合產(chǎn)物在源、庫(kù)中的分配和影響，發(fā)現(xiàn)水稻內(nèi)生成團(tuán)泛菌可以調(diào)控光合產(chǎn)物在旗葉（源）、穗（庫(kù)）中的分配，在水稻子粒乳熟初期，噴施ＹＳ１９菌液有助于旗葉光合產(chǎn)物向穗的運(yùn)輸，而向根、葉鞘運(yùn)輸?shù)墓夂袭a(chǎn)物很少，在乳熟后期則有抑制作用，原因是與ＹＳ１９菌株產(chǎn)生的激素有關(guān)。

綜上所述，可以判斷從稗草中分離的ＨＡＵＭ１０可以侵染定植于水稻中，這是其促生性質(zhì)被廣泛利用的基礎(chǔ)。ＨＡＵＭ１０對(duì)水稻的促生效應(yīng)包括固氮、產(chǎn)生生長(zhǎng)激素、有助于水稻葉綠素合成促進(jìn)光合作用以及水稻生長(zhǎng)后期氮、磷元素由葉向穗轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 張瑞丹． 濫用的化肥：中國(guó)占全球７％的耕地 消耗３５％的氮肥［ＥＢ／ＯＬ］．ｈｔｔｐ：／／ｆｉｎａｎｃｅ．ｉｆｅｎｇ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｓｐｅｃｉａｌ／ｃｘｃｍｚｋ／２０１００３０１／１８６９４１８．ｓｈｔｍｌ， ２０１０－０３－０１．

［２］ 張啟發(fā)．綠色超級(jí)稻的構(gòu)想與實(shí)踐［Ｍ］．北京：科學(xué)出版社，２００９．１－２．

［３］ ＨＡＬＬＭＡＮＮ Ｊ， ＱＵＡＤＴ－ＨＡＬＬＭＡＮＮ Ａ，ＭＡＨＡＦＦＥＥ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｒｏｐｓ［Ｊ］． Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，４３（１０）：８９５－９１４．

［４］ ＲＯＳＥＮＢＬＵＥＴＨ Ｍ， ＭＡＲＴ?魱ＮＥＺ－ＲＯＭＥＲＯ Ｅ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ａｎｄｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｏｓｔｓ［Ｊ］． ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔ Mｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２００６，１９（８）：８２７－８３７．

［５］ ＸＩ Ｃ Ｗ， ＬＡＭＢＲＥＣＨＴ Ｍ， ＶＡＮＤＥＲＬＥＹＤＥＮ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｆｐ ａｎｄ ｇｕｓＡ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｉｎｉ－Ｔｎ５ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Mｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Mｅｔｈｏｄｓ，１９９９，３５（１）：８５－９２．

［６］ 趙斌，何紹江．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［Ｍ］．北京：科學(xué)出版社，２００２．

［７］ ＵＥＤＡ Ｔ， ＳＵＧＡ Ｙ， ＹＡＨＩＲＯ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ Ｎ２－ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｒｉｃｅ ｒｏｏｔｓ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １９９５，１７７（５）：１４１４－１４１７．

［８］ Ｄ?魻ＢＥＲＥＩＮＥＲ Ｊ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉfiｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｅｒｏｂｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－fiｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ａｎｄ ｐｌａｎｔｓ［Ａ］． ＡＬＥＦＫ， ＮＡＮＮＩＰＩＥＲＩ Ｐ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｃ］． Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ｔｏｋｙｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９５．１３４-１４１．

［９］ ＲＥＮＮＩＥ Ｒ Ｊ． Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｙｌｅｎｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ （ｄｉｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ）ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌｓ［Ｊ］． Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８１，２７（１）：８－１４．

［１０］ ＧＯＶＩＮＤＡＲＡＪＡＮ Ｍ， ＢＡＬＡＮＤＲＥＡＵ Ｊ， ＫＷＯＮ Ｓ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ ｇｒａｉｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｒｉｃｅ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００８，５５（１）：２１－３７．

［１１］ 王學(xué)奎．植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［Ｍ］．第二版． 北京：高等教育出版社，２００６．１３０－１３３

［１２］ 魯如坤．土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法［Ｍ］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，２０００．

［１３］ ＣＯＭＰＡＮＴ Ｓ， ＲＥＩＴＥＲ Ｂ， ＳＥＳＳＩＴＳＣＨ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ． ｂｙ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ ＰｓＪＮ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，７１（４）： １６８５－１６９３．

［１４］ ＧＹＡＮＥＳＨＷＡＲ Ｐ，ＪＡＭＥＳ Ｅ Ｋ， ＭＡＴＨＡＮ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ ｂｙ ａ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００１， １８３（８）：２６３４－２６４５．

［１５］ ＪＨＡ Ｐ，ＫＵＭＡＲ Ａ． Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｈａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ ｂｙ ａ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ｓｔｒａｉｎ ＧＲ－３［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００７， １０３（４）：１３１１－１３２０．

［１６］ ＭＡＴＴＯＳ Ｋ Ａ， Ｐ?魣ＤＵＡ Ｖ Ｌ Ｍ， ＲＯＭＥＩＲＯ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｂｙ ｔｈｅ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］． Ａｎａｉｓ ｄａＡｃａｄｅｍｉａＢｒａｓｉｌｅｉｒａ ｄｅ Ｃｉêｎｃｉａｓ， ２００８， ８０（３）：４７７－４９３．

［１７］ 顏思齊，楊大旗，肖建國(guó)．水稻豐收菌［Ｍ］．北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，１９９２．５４－５７．

［１８］ 沈德龍，馮永君，宋未．內(nèi)生成團(tuán)泛菌ＹＳ１９對(duì)水稻乳熟期光合產(chǎn)物在旗葉、穗分配中的影響［Ｊ］． 自然科學(xué)進(jìn)展，２００２， １２（８）：８６３－８６５．