復(fù)合酶法提取金針菇多糖及光譜分析

梁敏 鄒東恢 郭宏文 李昂

摘要：研究了復(fù)合酶法提取金針菇（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）多糖的最佳工藝條件，并對金針菇多糖進(jìn)行了光譜分析。采用木瓜蛋白酶、纖維素酶復(fù)合處理，對加酶質(zhì)量比、酶解溫度、ｐＨ、酶解時間4個因素對多糖提取率的影響進(jìn)行了正交試驗(yàn)。確定了復(fù)合酶法提取金針菇多糖的最佳工藝條件為酶解溫度６０ ℃，復(fù)合酶添加量０．５％，加酶質(zhì)量比（木瓜蛋白酶∶纖維素酶）２∶１，ｐＨ ６．０，酶解時間２ ｈ，此條件下多糖提取率可達(dá)９．１％。

關(guān)鍵詞：金針菇（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）多糖；復(fù)合酶法提??；正交試驗(yàn)；光譜分析

中圖分類號：Ｓ６４６．１＋５；ＴＳ２０１．１文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）06－1210-04

Combined-Enzyme Extraction and Spectral Analysis of Flammulina velutipes Polysaccharides

LIANG Mina,ZOU Dong-huib,GUO Hong-wenb, LI Angb

（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｂ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｑｉｑｉｈａｒ Uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｑｉｑｉｈａｒ １６１００６， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ－ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｄｏｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｎｄ ｐａｐａｉｎ， ｐＨ， ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｗere ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ test． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ６０ ℃； Mａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｎｚｙｍｅ， ０.５％； Aｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｐａｐａｉｎ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ， ２∶１； ｐＨ， ６．０； Rｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ２ ｈ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ９．１％ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ； ｃｏｍｂｉｎｅｄ－ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｓｐｅｃｔｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ

金針菇（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）又名冬菇、樸菇、構(gòu)菌、青杠菌、毛柄金錢菌，隸屬擔(dān)子菌亞門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）層菌綱（Ｈｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）傘菌目（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）口蘑科（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｔａｃｅａｅ）金錢菌屬（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）。金針菇菌蓋滑嫩、菌柄細(xì)長脆嫩、形美、味鮮，是世界上著名的食藥兩用菌和觀賞菌［１］，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，有廣闊的開發(fā)前景。

金針菇子實(shí)體中除含有蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素和對人體有益的微量元素外還含有一種重要的生物活性高分子多糖，金針菇多糖由于具有抑制腫瘤、抗癌、增強(qiáng)肌體免疫力［２－４］等作用而受到廣泛重視。如何提高金針菇多糖的提取率、降低成本已成為拓展金針菇使用范圍、提高其應(yīng)用價值的關(guān)鍵。

傳統(tǒng)的浸提法雖然是提取多糖的經(jīng)典方法，但時間長、效率低、能耗大；金針菇多糖通常被包裹在植物細(xì)胞壁內(nèi)，并且多糖往往和蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以蛋白質(zhì)多糖的形式存在。研究表明中性蛋白酶能有效酶解與多糖結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)，從而將多糖釋放出來而提高多糖提取率，同時降低了多糖中蛋白質(zhì)的含量，提高了多糖的純度［５］。復(fù)合酶法處理可以提高多糖提取率、減少能源消耗、縮短提取時間。因此，探索更為高效、經(jīng)濟(jì)、可靠的提取方法對金針菇多糖的研究開發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料取市售新鮮金針菇，除去根部，清洗切塊，粉碎，干燥，過４０、６０、８０、１００目篩，過篩之后把各級金針菇干粉分別裝到清潔干燥的燒杯中，置于真空干燥箱中待用。

1.1.2試劑苯酚，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；葡萄糖，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５色譜柱，Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；纖維素酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶，北京世紀(jì)時尚科貿(mào)有限公司。所用試劑均為分析純。

１．１．3儀器與設(shè)備電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；７２２型紫外分光光度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；離心機(jī)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；九陽料理機(jī)：山東九陽小家電有限公司；ＴＨＺ－８２Ａ型臺式恒溫振蕩器：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Ｌａｍｂｄａ－３５紫外可見分光光度計(jì)：美國ＰＥ公司；Ｓｐｅｃｔｕｍ ｏｎｅ傅里葉變換紅外光譜儀：美國ＰＥ公司。

１．２方法

１．２．1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖。得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為■＝０．００７ ３ｘ＋０．０１４ ６，ｒ＝０．９９６ ６，在０～５０ μｇ／ｍＬ范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

１．２．2多糖清液的提取方法稱?。福啊保埃澳康慕疳樄礁煞郏?ｇ，放入２５０ ｍＬ的三角瓶中，加入一定量去離子水，混合均勻后置于５０ ℃水浴鍋中水浴３０ ｍｉｎ，調(diào)節(jié)ｐＨ，稱取木瓜蛋白酶和纖維素酶按一定比例混合，加入５ ｍＬ去離子水溶解，金針菇溶液放在水浴中預(yù)熱至酶解溫度，將酶液加入到金針菇溶液中，在恒溫振蕩器上提取，反應(yīng)結(jié)束，將三角瓶放到沸水鍋中，沸水?。保?ｍｉｎ滅酶，滅酶結(jié)束冷卻至室溫，將酶提取液放入到離心管中，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心，取上清液，即得到復(fù)合酶法提取的多糖清液。

１．２．3蛋白質(zhì)的去除方法采用Ｓｅｖａｇ法去除多糖清液中的蛋白質(zhì)［6］。在多糖清液中加入其１／４體積的氯仿－正丁醇（氯仿與正丁醇體積比４∶１），將其置于具塞試管中，充分搖勻３０ ｍｉｎ后用離心機(jī)離心１０ ｍｉｎ，剔去下面的白色渾濁液，取上清液，這樣的操作重復(fù)進(jìn)行３～４次即可除去蛋白質(zhì)。

１．２．4多糖的獲得方法金針菇多糖在水中的溶解度較大，所以先用去離子水初步提取，之后取上清液，用２0 g/L的活性炭脫色１ ｈ，加入體積分?jǐn)?shù)為９５％的乙醇，使溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到７５％進(jìn)行醇沉，醇沉過程中要將其保存在４ ℃冰箱中，保持２４ ｈ后５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，取沉淀，置于真空干燥箱中干燥，即可得到金針菇多糖［7］。

１．２．5多糖含量的測定方法采用苯酚－硫酸比色法［8］，苯酚－硫酸法是以硫酸、苯酚作為顯色劑，它們與金針菇多糖發(fā)生顯色反應(yīng)后在４９０ ｎｍ波長處測定其吸光度，再通過已經(jīng)獲得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求得金針菇中的多糖含量。

１．２．６單因素試驗(yàn)

１）物料粒度對金針菇多糖提取率的影響。將金針菇粉通過４０、６０、８０、１００目篩，分別得到小于４０目、４０～６０目、６０～８０目、８０～１００目和１００目以上的金針菇粉，取一定量的以上５種樣品，選擇料水質(zhì)量比１∶１５，５０ ℃水浴中提?。?ｈ，計(jì)算各樣品的多糖提取率，研究物料粒度對金針菇多糖提取率的影響。

２）料水質(zhì)量比對金針菇多糖提取率的影響。等量稱?。福啊保埃澳康慕疳樄椒郏捣荩x擇料水質(zhì)量比１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０，分別于５０℃水浴中提出１ｈ，計(jì)算各樣品的多糖提取率，研究料水質(zhì)量比對金針菇多糖提取率的影響。

３）復(fù)合酶添加量對金針菇多糖提取率的影響。等量稱?。福啊保埃澳康慕疳樄椒郏捶?，選擇料水質(zhì)量比１∶２０，加入適量復(fù)合酶［加酶質(zhì)量比（木瓜蛋白酶∶纖維素酶）＝１∶１），控制復(fù)合酶質(zhì)量分別為金針菇粉質(zhì)量的０．３％、０．４％、０．５％、０．６％，在５０℃水浴中提?。?ｈ，計(jì)算各樣品的多糖提取率，研究復(fù)合酶添加量對金針菇多糖提取率的影響。

1.2.7正交試驗(yàn)影響金針菇多糖的提取因素很多，通過預(yù)試驗(yàn)選擇其中的4個因素作為研究的對象：加酶質(zhì)量比（木瓜蛋白酶∶纖維素酶）、酶解溫度、pH、酶解時間。采用四因素三水平正交試驗(yàn)確定提取金針菇多糖的最佳條件，因素與水平見表1。

１．２．8多糖的色譜分離純化方法金針菇多糖粗品水溶解后，取１０ ｍＬ上Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５色譜柱。用恒流泵控制流速（２０ ｍＬ／ｈ），自動部分收集器收集，每管收集２．０ ｍＬ，用苯酚－硫酸法測定各洗脫液于４９０ ｎｍ處的吸光度，收集其流出液，冷凍干燥得到純化后的樣品。

1.2.9多糖成分分析方法

1）紅外吸收光譜分析。采用美國ＰＥ公司的Ｓｐｅｃｔｕｍ ｏｎｅ傅里葉變換紅外光譜儀，在４００~４ ０００ cｍ-1范圍內(nèi)對提取的金針菇多糖進(jìn)行紅外吸收光譜掃描。

2）紫外吸收光譜分析。采用美國ＰＥ公司的Ｌａｍｂｄａ－３５紫外可見光分光光度計(jì)，在１９０～800 ｎｍ范圍內(nèi)對提取的金針菇多糖進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。

２結(jié)果與分析

２．１單因素試驗(yàn)結(jié)果

２．１．１物料粒度對金針菇多糖提取率的影響從圖1可知，小于４０目、４０～６０目、６０～８０目、８０～１００目和１００目以上的金針菇粉的多糖提取率分別為２．７%、２．９%、３．１%、３．４%和３．３%，由此可知８０～１００目的金針菇粉多糖提取率最高（圖１）。因此試驗(yàn)選定物料粒度為８０～１００目。

２．１．２料水質(zhì)量比對金針菇多糖提取率的影響從圖2可知，料水質(zhì)量比為１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０的條件下金針菇的多糖提取率分別為２．３%、３．１%、３．４%、３．５%和３．５%，當(dāng)料水質(zhì)量比在１∶１５和1∶10之間，隨著料水質(zhì)量比的減小，多糖提取率較快地增長，繼續(xù)減小料水質(zhì)量比多糖提取率仍有升高，但升高速率減小。在提取中加水太少、太多皆不利于以后的分離，而且加重了生產(chǎn)中的負(fù)擔(dān)。因此試驗(yàn)確定料水質(zhì)量比為１∶２０。

２．１．３復(fù)合酶添加量對金針菇多糖提取率的影響從圖３可以看出，隨著復(fù)合酶添加量的增加，多糖提取率也逐漸增加，復(fù)合酶添加量大于０．５％后多糖提取率增加趨于平緩，考慮到酶的成本及效果，復(fù)合酶添加量宜為０．５％。

２．２金針菇多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2中４個因素的極差值可知，影響金針菇多糖提取率的4個因素的主次順序是Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ。通過正交試驗(yàn)可知復(fù)合酶法提取金針菇多糖的最佳工藝條件為Ａ３Ｂ２Ｃ２Ｄ２，即加酶質(zhì)量比（木瓜蛋白酶∶纖維素酶）為２∶１，酶解溫度為６０ ℃，ｐＨ ６．０，酶解時間為２ ｈ，此時金針菇的多糖提取率為９．１％。

２．3金針菇的多糖成分分析結(jié)果

２．3．１金針菇多糖結(jié)構(gòu)紅外吸收光譜分析結(jié)果紅外吸收光譜是有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)表征的重要方法，在實(shí)驗(yàn)室得到了普遍的應(yīng)用。有機(jī)化合物的化學(xué)鍵或官能團(tuán)都有各自的特征振動頻率，因此可以測定化合物的紅外吸收光譜，根據(jù)吸收帶的位置，推斷出分子中可能存在的化學(xué)鍵或官能團(tuán)，再結(jié)合其他信息便可確定化合物的結(jié)構(gòu)［９，１０］。由圖4可知，３ ４７５和３ ４１６ ｃｍ－１處峰值是由多糖中Ｏ－Ｈ的伸縮振動引起的，羥基在分子間發(fā)生締合，并不是游離的；在２ ９０７ ｃｍ－１處是由多糖中Ｃ－Ｈ的伸縮振動引起的；在１ ６３７～１ ６１８ ｃｍ－１處吸收峰是－ＣＨＯ的Ｃ＝Ｏ的伸縮振動引起的，為肽鏈上酰胺碳基的吸收峰；在１ ５６４ ｃｍ－１處是由多糖中Ｃ－Ｈ的變角振動引起的；在１ ４７２ ｃｍ－１處是由多糖中Ｃ－Ｏ－Ｃ和Ｃ－Ｏ－Ｈ的伸縮振動引起的；在８４９ ｃｍ－１處是由β－吡喃環(huán)中Ｃ－Ｈ的變角振動引起的；在８２０ ｃｍ－１處為α－吡喃環(huán)中Ｃ１－Ｈ的變角振動吸收峰；在８０５ ｃｍ－１處是由吡喃環(huán)中Ｃ１－Ｈ的變角振動引起的。金針菇多糖具有典型的多糖物質(zhì)的吸收峰，而且多糖中存在吡喃環(huán)和呋喃環(huán)，具有α、β構(gòu)型。

２．3．２金針菇多糖結(jié)構(gòu)紫外吸收光譜分析結(jié)果紫外吸收光譜應(yīng)用廣泛，可用于有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)表征以及有機(jī)化合物的定量分析。由于此法靈敏度較高，能檢測出１０－５～１０－４ ｍｏｌ／Ｌ濃度的化合物，因此在試驗(yàn)中可采用此法測定其中的微量雜質(zhì)如核酸和蛋白質(zhì)［１１，１２］。由圖5可知，得到的紫外吸收光譜較為光滑，在核酸（吸收峰２６０ ｎｍ）和蛋白質(zhì)（吸收峰２８０ nｍ）吸收波長處未出現(xiàn)峰值，所以核酸和蛋白質(zhì)的含量較小。

３結(jié)論與討論

采用正交試驗(yàn)確定了金針菇多糖復(fù)合酶法提取的最佳工藝條件，即木瓜蛋白酶與纖維素酶質(zhì)量比為２∶１，復(fù)合酶添加量為0.5%，酶解溫度為６０ ℃，ｐＨ為６．０，酶解時間為２ ｈ，此時多糖提取率為９．１％。

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