轉(zhuǎn)錄因子基因Mfhb-1的表達(dá)對(duì)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響

周巖 何男男 魏琦超 張勝利 薛曉鋒 趙俊杰

摘要：Ｍｆｈｂ－１基因是在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)早期經(jīng)扣除雜交得到的ＨＤ－Ｚｉｐ Ⅰ類轉(zhuǎn)錄因子基因，相關(guān)研究表明，Ｍｆｈｂ－１基因在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)的早期可能發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步探討Ｍｆｈｂ－１基因的生物學(xué)功能與營(yíng)養(yǎng)元素吸收的關(guān)系，試驗(yàn)以經(jīng)２，４－Ｄ誘導(dǎo)的苜蓿幼嫩葉片的葉肉細(xì)胞為材料，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜技術(shù)，對(duì)Ｍｆｈｂ－１基因的正義、反義轉(zhuǎn)化植株體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的１０種營(yíng)養(yǎng)元素含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)可能在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)初期促進(jìn)了對(duì)Ｎａ元素的吸收，同時(shí)抑制了對(duì)Ｍｇ、Ｚｎ元素的吸收；Ｃｕ、Ｋ、Ｆｅ、Ｍｎ等元素的含量變化可能受Ｍｆｈｂ－１基因表達(dá)的影響較小。不過Ｍｆｈｂ－１基因表達(dá)與營(yíng)養(yǎng)元素吸收的關(guān)系，以及進(jìn)而如何影響苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生的詳細(xì)分子作用機(jī)理等有待于進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：苜蓿；Ｍｆｈｂ－１基因；ＨＤ－Ｚｉｐ轉(zhuǎn)錄因子；體細(xì)胞胚胎；營(yíng)養(yǎng)元素；電感耦合等離子體發(fā)射光譜技術(shù)

中圖分類號(hào)：Ｓ５４１＋．１；Ｑ７８６；Ｑ８１３．７ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）06－1165-06

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｍｆｈｂ－１ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ

ＺＨＯＵ Ｙａｎ１，ＨＥ Ｎａｎ－ｎａｎ１，２，ＷＥＩ Ｑｉ－ｃｈａｏ１，ＺＨＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉ１，ＸＵＥ Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＡＯ Ｊｕｎ－ｊｉｅ１

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｏｎｇｑｉ Ｆａｒｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｒｏｐｓ， Ｃｈａｎｇｊｉ ８３１７０２，Ｘｉｎｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｎａｍｅｄ Ｍｆｈｂ－１ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ． ｂｙ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ＨＤ－Ｚｉｐ Ｉ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ． Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｈａｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｏ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍ． ｆａｌｃａｔａ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｙｏｕｎｇ ｌｅａｆ ｃｅｌｌ ｆｒｏｍ ｓｅｎｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ２，４－Ｄ ｔｏ ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ， １０ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｒｖｅｙｅｄ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＩＣＰ－ＡＥＳ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｍｏｓｔ ｌｉｋｅｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｎａ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｗｈｉｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｍｇ， Ｚｎ ｅｌｅｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍ． ｆａｌｃａｔａ； Aｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ， ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｈａｄ ｎｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｕ， Ｋ， Ｆｅ ａｎｄ Ｍｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏ ｔｈａｔ ｔｏ ｔａｋｅ ａ ｓｔｅｐ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｉｎｓｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ．； Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ； ＨＤ－Ｚｉｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ； ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ； ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ； ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ

苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ．）是研究植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的典型模式植物之一，Ｍｆｈｂ－１基因是在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)早期，經(jīng)扣除雜交得到的 同源異型域——亮氨酸拉鏈蛋白（Hemeodomain leuzine zipper，HD-Zip）Ⅰ類轉(zhuǎn)錄因子基因。為了研究該基因的生物學(xué)功能，在前期利用正義、反義轉(zhuǎn)化技術(shù)將該基因?qū)氲搅塑俎Ｖ?，并已得到該基因過量表達(dá)和低量表達(dá)的轉(zhuǎn)化植株［１，２］。

轉(zhuǎn)錄因子對(duì)各種功能基因的調(diào)控作用可能受到光照、植物激素、低溫等逆境條件的影響。營(yíng)養(yǎng)元素是植物體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)的關(guān)鍵輔助因子，因而在參與調(diào)控植物早期生長(zhǎng)發(fā)育及其植物形態(tài)構(gòu)建的過程中發(fā)揮著重要作用。前期研究結(jié)果顯示，基因的表達(dá)可能與苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程密切相關(guān)［１］，但具體的分子機(jī)理尚不清楚。本研究利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＩＣＰ－ＡＥＳ）法檢測(cè)Ｍｆｈｂ－１基因正義、反義轉(zhuǎn)化植株體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的１０種營(yíng)養(yǎng)元素含量，以探討Ｍｆｈｂ－１的過量表達(dá)或低量表達(dá)對(duì)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中營(yíng)養(yǎng)元素的吸收產(chǎn)生的影響，從而確定在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中該基因表達(dá)與營(yíng)養(yǎng)元素含量變化的關(guān)系，進(jìn)而為全面揭示Ｍｆｈｂ－１基因作用的分子機(jī)理提供相關(guān)的研究方法和理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１植物材料

試驗(yàn)所用的苜蓿材料共有４ 種，分別是４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４、Ｃ５；其中４７／１－５為苜蓿未轉(zhuǎn)化的材料，作為試驗(yàn)的對(duì)照；Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５是以 ４７／１－５為起始材料經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體，Ｄ３為攜帶Ｍｆｈｂ－１基因編碼區(qū)反向序列的反義轉(zhuǎn)化植株；Ｆ４為攜帶Ｍｆｈｂ－１ 基因編碼區(qū)序列的正義轉(zhuǎn)化植株；Ｃ５為攜帶全長(zhǎng) Ｍｆｈｂ－１基因，包括編碼區(qū)以及該編碼區(qū)上游的保守序列開放閱讀框（upstream open reading frames，uORF）序列的正義轉(zhuǎn)化植株。４ 種苜蓿材料均在ＭＳ固體培養(yǎng)基、２２ ℃、光照時(shí)間１６ ｈ／ｄ的條件下進(jìn)行試驗(yàn)材料的擴(kuò)大培養(yǎng)。

參照Ｄｅｎｃｈｅｖ等建立的的苜蓿直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系［３］，取培養(yǎng)８～１２ ｄ的植株，剪下靠近頂端的葉片約 １２片，在含有少許 Ｂ５Ｏ培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿里切成小塊，然后吸出液體，把切碎的葉片轉(zhuǎn)入含有４０ ｍＬ Ｂ５Ⅳ（２，４－Ｄ ４．０ ｍｇ／ｍＬ）培養(yǎng)基的１００ ｍＬ三角瓶里，進(jìn)行液體懸浮振蕩培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)其體細(xì)胞胚胎發(fā)生，誘導(dǎo)時(shí)間為１８ ｄ。然后轉(zhuǎn)入Ｂ５／３ Ｍ培養(yǎng)基中，使前期葉肉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物繼續(xù)發(fā)育，每 １０ ｄ 更換培養(yǎng)基一次，共發(fā)育培養(yǎng)３０ ｄ。培養(yǎng)條件為溫度 ２２ ℃、光照時(shí)間１６～1８ ｈ／ｄ、轉(zhuǎn)速為１２０ ｒ／ｍｉｎ。在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)的開始、第五天、第十天、第十五天、第十八天和發(fā)育培養(yǎng)的第十天、第二十天、第三十天分別取材，并稱?。?ｇ培養(yǎng)物，３次重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后放入超低溫冰箱（－８０ ℃）中保存，待用。

將材料從超低溫冰箱中取出后放入烘箱中，１０５ ℃殺青３ ｈ，８０ ℃烘干至恒重，轉(zhuǎn)移至瓷坩堝中，用馬弗爐２００ ℃ 炭化１ ｈ、４００ ℃灰化３ ｈ，至灰化完全（無黑色顆粒）后取出冷卻，加 ３ ｍＬ ＨＣｌ－ＨＣｌＯ４（４∶１，體積比）混合液混勻，在電阻板上加熱至完全溶解，定容至１０ ｍＬ。

１．２Ｍｆｈｂ－１基因結(jié)構(gòu)

Ｍｆｈｂ－１基因正義與反義結(jié)構(gòu)如圖１所示，在圖１中，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ２為攜帶Ｍｆｈｂ－１基因編碼區(qū)上游的開放閱讀框（ｕＯＲＦ）序列；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ３為Ｍｆｈｂ－１基因反義編碼區(qū)，Ｄ３ 植株攜帶該片段；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ４為Ｍｆｈｂ－１基因正義編碼區(qū)（ＣＤＳ），Ｆ４植株攜帶該片段；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ５為Ｍｆｈｂ－１基因全長(zhǎng)序列（開放閱讀框＋編碼區(qū)序列），Ｃ５植株攜帶該片段。

１．３主要試劑與設(shè)備

ＨＣｌ、ＨＣｌＯ４、ＨＮＯ３均為分析純，由天津德恩化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；試驗(yàn)用水均為超純水，由德國(guó)ＳＧ公司Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｒ ＵＶ Ｐｌｕｓ超純水機(jī)現(xiàn)制現(xiàn)用。

使用Ｏｐｔｉｍａ ２１００ ＤＶ電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（美國(guó)ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公司），垂直觀測(cè)，觀察位置自動(dòng)優(yōu)化；雙陣列背投式固態(tài)ＣＣＤ檢測(cè)器光學(xué)系統(tǒng)、ＲＹＴＯＮ材料霧化器、內(nèi)置式三通道蠕動(dòng)泵、４０．６８ ＭＨｚ 自激式固態(tài)高頻發(fā)生器、空氣切割消除尾焰技術(shù)系統(tǒng)、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ循環(huán)水冷卻系統(tǒng)等均為實(shí)驗(yàn)室原已具備的儀器。

營(yíng)養(yǎng)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液為Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ 混合標(biāo)準(zhǔn)液，濃度均為１ ０００ μｇ／ｍＬ（德國(guó)默克公司）。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用體積分?jǐn)?shù)為２％ 的 ＨＮＯ３逐級(jí)稀釋，Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ等混合標(biāo)準(zhǔn)液按０．００、０．５０、１．００、２．００、４．００、８．００ μｇ／ｍＬ梯度進(jìn)行配制。

１．４ＩＣＰ－ＡＥＳ工作參數(shù)

用ＩＣＰ－ＡＥＳ檢測(cè)樣品溶解液中Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ的離子濃度，ＩＣＰ－ＡＥＳ儀器工作參數(shù)分別是工作功率１．３ ｋＷ、輔助氣體流量０．２ Ｌ／ｍｉｎ、冷卻氣體流量１５．０ Ｌ／ｍｉｎ、載氣０．８ Ｌ／ｍｉｎ、進(jìn)樣泵流量１．５ Ｌ／ｍｉｎ，

２結(jié)果與分析

２．１分析波長(zhǎng)的選擇及背景的校正

ＩＣＰ－ＡＥＳ法對(duì)每種營(yíng)養(yǎng)元素的測(cè)定都可以同時(shí)選擇多條特征譜線，且具有同步背景校正功能。因此，試驗(yàn)過程中對(duì)每種檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)元素同時(shí)選?。病硹l譜線進(jìn)行測(cè)定，綜合分析強(qiáng)度、干擾情況及穩(wěn)定性，選擇譜線干擾少、精密度高的分析線。各營(yíng)養(yǎng)元素的分析波長(zhǎng)選擇結(jié)果分別是Ｃｕ ３２４．７５ ｎｍ、Ｆｅ ２５９．９３ ｎｍ、Ｚｎ ２１３．８５ ｎｍ、Ｍｎ ２５７．６１ ｎｍ、Ｎａ ５８９．５９ ｎｍ、Ｋ ７６６．４９ ｎｍ、Ｃａ ３１７．９３ ｎｍ、Ｍｇ ２７９．０７ ｎｍ、Ｓｅ １９６．０２ ｎｍ、Ｃｏ ２２８．８５ ｎｍ。

２．２回歸方程和相關(guān)系數(shù)

按選擇的工作條件檢測(cè)各營(yíng)養(yǎng)元素在配制好的系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液下的峰面積，用峰面積（ｙ）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ｘ，μｇ／ｍＬ）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。各營(yíng)養(yǎng)元素的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表１。

２．３樣品測(cè)定結(jié)果

經(jīng)ＩＣＰ－ＡＥＳ檢測(cè)，４種苜蓿材料中Ｃｏ元素和Ｓｅ元素含量的測(cè)定結(jié)果為負(fù)值，低于系統(tǒng)檢出限；其他８種營(yíng)養(yǎng)元素的測(cè)定結(jié)果見圖２，其中圖２Ａ為Ｃａ元素的含量動(dòng)態(tài)變化，圖２Ｂ為Ｍｇ元素的含量動(dòng)態(tài)變化，圖２Ｃ為Ｎａ元素的含量動(dòng)態(tài)變化，圖２Ｄ為Ｚｎ元素的含量動(dòng)態(tài)變化，圖２Ｅ為Ｃｕ元素的含量動(dòng)態(tài)變化，圖２Ｆ為Ｋ元素的含量動(dòng)態(tài)變化，圖２Ｇ為Ｆｅ元素的含量動(dòng)態(tài)變化，圖２Ｈ為Ｍｎ元素的含量動(dòng)態(tài)變化。

由４種苜蓿材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中各營(yíng)養(yǎng)元素含量動(dòng)態(tài)變化可以看出，Ｃａ元素在４種苜蓿材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中均表現(xiàn)出先下降后上升再下降并保持平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第五天，４種苜蓿材料的Ｃａ元素含量由高到低表現(xiàn)為Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３；在誘導(dǎo)培養(yǎng)后期（１８ ｄ），Ｃ５和Ｆ４的Ｃａ元素含量上升，Ｄ３和４７／１－５的Ｃａ元素含量保持平穩(wěn)的態(tài)勢(shì)。

Ｍｇ元素含量在４種苜蓿材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化較為復(fù)雜。在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)階段內(nèi)，除４７／１－５表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)外，Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５均表現(xiàn)出先上升后下降的變化，而Ｄ３的峰值在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十天出現(xiàn)，早于Ｃ５的第十五天，也早于F4的發(fā)育培養(yǎng)階段第十天。Ｍｇ元素含量在發(fā)育培養(yǎng)階段的初期（發(fā)育培養(yǎng)１０ ｄ）還有一個(gè)高峰出現(xiàn)，此時(shí)４種苜蓿材料的Ｍｇ元素含量由高到低分別為Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３。

Ｎａ元素含量在４種苜蓿材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的變化波動(dòng)較為復(fù)雜，Ｆ４和４７／１－５大致表現(xiàn)為在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第五天有一個(gè)高峰，然后下降，最后在發(fā)育培養(yǎng)階段的末期有一個(gè)小幅上升；Ｃ５的Ｎａ元素含量在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段峰值出現(xiàn)前有一個(gè)下降的過程，誘導(dǎo)培養(yǎng)的第五天開始迅速上升，誘導(dǎo)培養(yǎng)的第十天達(dá)峰值后開始下降，在發(fā)育培養(yǎng)階段表現(xiàn)出與Ｆ４和４７／１－５類似的變化趨勢(shì)；Ｄ３的Ｎａ元素含量在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段一直增加，在發(fā)育培養(yǎng)階段開始后才表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

Ｚｎ元素含量在４種苜蓿材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的變化十分明顯，除了Ｄ３的峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十天外，其他３種材料的峰值均出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十五天，４種材料在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的Ｚｎ元素含量峰值由高到低分別為Ｄ３、Ｃ５、４７／１－５、Ｆ４。而在發(fā)育培養(yǎng)階段開始后，4種苜蓿材料的Ｚｎ元素含量基本上一直處于很低的水平，并且保持平穩(wěn)。

Ｃｕ元素含量在４種苜蓿材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的變化跌宕起伏，Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３都表現(xiàn)為在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)；進(jìn)入發(fā)育培養(yǎng)階段后，都是先上升后下降；以４７／１－５材料的Ｃｕ元素含量最高，峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十五天；其次是Ｃ５材料，Ｃｕ元素含量峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十天；第三是Ｄ３材料，Ｃｕ元素含量峰值出現(xiàn)在發(fā)育培養(yǎng)階段的第十天；而Ｆ４材料的Ｃｕ元素含量峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十五天。到發(fā)育培養(yǎng)階段結(jié)束前１０ ｄ（發(fā)育培養(yǎng)２０ ｄ），４種材料的Ｃｕ元素含量都處在最低值，并且一直維持到發(fā)育培養(yǎng)階段結(jié)束。

Ｋ元素含量在４種苜蓿材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中基本上處于下降的趨勢(shì)，４種材料的Ｋ元素含量峰值大都沒有超過誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的起始水平；到發(fā)育培養(yǎng)階段結(jié)束時(shí)（發(fā)育培養(yǎng)３０ ｄ），４種苜蓿材料的Ｋ元素含量由高到低分別為４７／１－５、Ｆ４、Ｃ５、Ｄ３。

Ｆｅ元素含量在苜蓿４種材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的變化起伏很大，在發(fā)育培養(yǎng)階段結(jié)束前１０ ｄ（發(fā)育培養(yǎng)２０ ｄ），與Ｃｕ元素含量的變化趨勢(shì)基本一致，4種材料的Fe元素含量大都處在最低值；但在發(fā)育培養(yǎng)２０ ｄ后，４種材料的Ｆｅ元素含量出現(xiàn)了戲劇性的變化，其含量水平大幅上升，最后都超過了前面水平，達(dá)到了峰值，此時(shí)４種苜蓿材料的Ｆｅ元素含量由高到低分別為Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４。

Ｍｎ元素含量在４種苜蓿材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的變化趨勢(shì)和Ｚｎ元素正好相反，其在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段基本上都處在較平穩(wěn)的狀態(tài)，而一進(jìn)入發(fā)育培養(yǎng)階段，４種材料的Ｍｎ元素含量立即大幅度上升，峰值出現(xiàn)在發(fā)育培養(yǎng)階段的第十天，而后迅速下降，到發(fā)育培養(yǎng)階段結(jié)束時(shí)，又恢復(fù)到誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的水平。４種材料的Ｍｎ元素含量達(dá)峰值時(shí)由高到低的排序?yàn)椋疲础ⅲ模?、４７／１－５、Ｃ５?/p>

３討論

３．１Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)對(duì)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育的影響

苜蓿４種材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育的顯微觀察［４，５］顯示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十天，Ｆ４和４７／１－５的表面會(huì)形成一些突起結(jié)構(gòu)；在第十五天時(shí)，Ｄ３和Ｃ５表面才出現(xiàn)微小的突起結(jié)構(gòu)。在發(fā)育培養(yǎng)階段，Ｄ３和Ｃ５的表面白色組織增多，且培養(yǎng)液渾濁不清，在發(fā)育培養(yǎng)的第三十天時(shí)，觀察到Ｆ４培養(yǎng)物中出現(xiàn)一些小的子葉胚，而其他３種材料多是魚雷胚。在發(fā)育培養(yǎng)的第二十八天時(shí)，統(tǒng)計(jì)４種材料的體細(xì)胞胚胎數(shù)目，由高到低依次為Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３。上述結(jié)果表明，Ｍｆｈｂ－１基因編碼區(qū)的表達(dá)可能促進(jìn)了苜蓿體細(xì)胞胚胎胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)，從而促進(jìn)了苜蓿體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，而ｕＯＲＦ的表達(dá)可能對(duì)該基因的表達(dá)有一定的抑制作用。

３．２Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)對(duì)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響

Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)可能促進(jìn)了苜蓿對(duì)Ｃａ元素的吸收。由圖２Ａ可以看出，在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的第五天，４種材料的Ｃａ元素含量由高到低依次為Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３，這與苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育情況和最后（發(fā)育培養(yǎng)的第二十八天［4，5］）體細(xì)胞胚胎數(shù)量所觀察到的排序結(jié)果相吻合。在誘導(dǎo)培養(yǎng)后期，Ｆ４和Ｃ５的Ｃａ元素含量上升，Ｄ３和４７／１－５的Ｃａ元素含量保持平衡，說明Ｃａ元素對(duì)胚性細(xì)胞的形成可能有一定的促進(jìn)作用，由此可推測(cè)Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)可能促進(jìn)了苜蓿體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)后期階段對(duì)Ｃａ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)可能促進(jìn)了苜蓿對(duì)Ｍｇ元素的吸收。圖２Ｂ表明，Ｍｇ元素含量在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的變化較為復(fù)雜。除４７／１－５表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)外，Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，而Ｄ３的峰值在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十天出現(xiàn)，早于Ｃ５的第十五天，也早于F4的發(fā)育培養(yǎng)階段第十天。在發(fā)育培養(yǎng)的初期，４種材料的Ｍｇ元素含量由高到低表現(xiàn)為Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３，并且與最后所觀察到的體細(xì)胞胚胎數(shù)目排序情況類似［４］；由此可推測(cè)Ｍｆｈｂ－１ 基因的表達(dá)可能促進(jìn)了苜蓿對(duì)Ｍｇ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)可能促進(jìn)了苜蓿對(duì)Ｎａ元素的吸收。圖２Ｃ揭示，Ｎａ元素含量在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中變化波動(dòng)較為復(fù)雜，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第五天，除了Ｃ５的Ｎａ元素含量呈下降趨勢(shì)外，其他３種材料的Ｎａ元素含量均呈上升趨勢(shì)，其中Ｆ４上升的最迅速；該現(xiàn)象可能是由于ｕＯＲＦ的表達(dá)而導(dǎo)致Ｃ５的Ｎａ元素含量峰值較Ｆ４與４７／１－５ 滯后。結(jié)合體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育觀察結(jié)果［４］，可以推測(cè)Ｍｆｈｂ－１基因的過量表達(dá)可能在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)的初期，就促進(jìn)了苜蓿對(duì)Ｎａ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)可能抑制了苜蓿對(duì)Ｚｎ元素的吸收。由圖２Ｄ可以觀察到，Ｚｎ元素含量在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的變化十分明顯，除了Ｄ３的峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十天外，其他３種材料的峰值均出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的第十五天，且４種材料在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段Ｚｎ元素含量峰值由高到低表現(xiàn)為Ｄ３、Ｃ５、４７／１－５、Ｆ４，與最后的體細(xì)胞胚胎數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果呈反比關(guān)系。由此表明，高含量的Ｚｎ元素可能不利于苜蓿胚性細(xì)胞的分化，由此可推測(cè)Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)育培養(yǎng)階段初期就可能抑制了對(duì)Ｚｎ元素的吸收。

在４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５這４種材料中，Ｃｕ元素、Ｋ元素、Ｆｅ元素、Ｍｎ元素含量在苜蓿體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)和發(fā)育過程中的變化大體趨于一致，表明 Ｍｆｈｂ－１基因的過量或低量表達(dá)，對(duì)Ｃｕ、Ｋ、Ｆｅ、Ｍｎ元素的含量變化影響不明顯。

３．３主要營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育的影響

目前對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素在體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育中的具體生物學(xué)功能的研究較少，主要集中在與體細(xì)胞胚胎發(fā)育模式相似的合子胚上。如許淑蘋［６］在研究杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook］合子胚的發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ｃｕ元素的含量在合子胚發(fā)育進(jìn)程中呈小幅上升變化；Ｐ元素含量總體上呈較大幅度上升；Ｋ、Ｍｎ、Ｃａ元素含量呈先下降后上升的變化；Ｍｇ元素含量在體胚發(fā)育的后期呈持續(xù)上升趨勢(shì)，而后達(dá)到最高值；Ｃｏ和Ｎｉ元素含量較低，Ｃｏ元素的含量不超過 １ μｇ／ｇ，Ｎｉ元素的含量不超過３ μｇ／ｇ。甄艷等［７］在研究濕地松（Pinus elliottii Engelmann）×加勒比松（P. caribaea Morelet）的雜種合子胚發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)Ｍｎ、Ｎｉ、Ｂ、Ｎａ、Ａｌ和Ｋ元素在胚胎發(fā)育早期的合子胚中含量最高；Ｐ、Ｍｇ和Ｆｅ元素呈相似的變化趨勢(shì)，在發(fā)育開始后先小幅下降而后隨胚發(fā)育逐漸上升；Ｃａ元素在合子胚發(fā)育早期的含量較高，隨后下降，而后大幅度上升，在合子胚發(fā)育后期達(dá)到最大值。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照材料４７／１－５的體胚發(fā)育培養(yǎng)１０ ｄ后，Ｋ、Ｎａ元素含量隨著胚胎的發(fā)育不斷升高；Ｚｎ元素含量總體變化不大；Ｃａ、Ｃｕ、Ｆｅ元素含量峰值均出現(xiàn)在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)或發(fā)育的中間階段，Mg元素含量峰值出現(xiàn)在體胚誘導(dǎo)末期；Mn元素含量峰值出現(xiàn)在體胚發(fā)育初期。

已有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的鈉離子可以使蛋白變性，也可以影響細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的功能［８］。液泡缺少鈉離子將會(huì)削弱酶的功能，也會(huì)限制生長(zhǎng)發(fā)育。擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）ａｔｒａｂ２８基因在胚胎形成后期表達(dá)，它編碼的核內(nèi)靶蛋白可以增加胚胎形成后期的陽離子容量，當(dāng)該蛋白在擬南芥中過量表達(dá)時(shí)還可以促進(jìn)擬南芥萌芽的發(fā)生［８］。鈣離子對(duì)于調(diào)節(jié)植物滲透壓扮演著重要的角色，不同的植物細(xì)胞對(duì)鈣離子存在不同的響應(yīng)，一般情況下，鈣離子在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中起到中心作用［９］，如在組織培養(yǎng)中，鈣離子的濃度變化體系中含有大量胚胎表達(dá)的鈣離子依賴蛋白激酶［１０］。鐵是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的元素，主要作為結(jié)構(gòu)螯合物或金屬蛋白存在于植物組織中，常參與氧化還原反應(yīng)，然而鐵的不溶性限制了它的吸收；通過細(xì)胞質(zhì)膜三磷酸腺苷酶的細(xì)胞外酸化，可以幫助將鐵泵進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，鐵被膜還原酶還原成二價(jià)鐵離子，然后轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)［１１］。黃立皓［１２］研究發(fā)現(xiàn)，Ｃｕ、Ｆｅ和Ｍｇ離子含量的增加可以提高愈傷組織中細(xì)胞的滲透勢(shì)，促進(jìn)細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的形成，從而提高愈傷組織分化率。Ｐｒｉｙａｎｋａ等［１３］在研究卵葉車前（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ Ｆｏｒｓｓｋ）體胚與非胚性愈傷組織中營(yíng)養(yǎng)元素含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，高含量的Ｋ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｃｕ和Ｚｎ是體胚形成的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照材料４７／１－５體細(xì)胞胚胎的發(fā)育過程中（轉(zhuǎn)入發(fā)育培養(yǎng)基１０ ｄ之后），體細(xì)胞胚胎發(fā)育培養(yǎng)物中的Ｋ、Ｎａ元素含量不斷上升，表明Ｋ、Ｎａ元素在苜蓿體胚的發(fā)育成熟過程中可能起重要的作用。

綜上所述，Ｍｆｈｂ－１基因的表達(dá)與苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中多種營(yíng)養(yǎng)元素含量的變化有著密切的關(guān)系。該基因的表達(dá)可能在體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程的不同階段，通過促進(jìn)植物體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收（如在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)前期促進(jìn)Ｎａ元素的吸收），同時(shí)抑制對(duì)另一些營(yíng)養(yǎng)元素的吸收（如在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)前期對(duì)Ｍｇ、Ｚｎ元素的吸收），或者通過影響這些營(yíng)養(yǎng)元素含量的變化趨勢(shì)或模式，從而參與調(diào)節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)程中各類基因群的表達(dá)，以及一系列相應(yīng)的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程的作用。但營(yíng)養(yǎng)元素含量與Ｍｆｈｂ－１基因表達(dá)在苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程中的相互關(guān)系，以及詳細(xì)的分子作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

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