病毒-宿主相互作用的系統(tǒng)生物學與宿主靶向抗病毒策略

伯曉晨，楊 靜，王升啟

(軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850)

病毒性疾病嚴重危害人類健康，歷史上幾次全球范圍的病毒性疾病流行給人類帶來了深重的災難。近年來，甲型H1N1流感、高致病性禽流感、SARS病毒等的肆虐造成了極大的社會恐慌和難以估算的經濟損失;病毒性生物恐怖劑制備技術的普及對人類安全構成了潛在威脅。雖然抗病毒藥物在近20年來有了很大發(fā)展，目前在臨床應用的抗病毒藥物已達40多種，但許多重要病毒性疾病仍然缺乏有效的治療藥物[1]。

由于病毒基因組編碼的蛋白數量非常少，以病毒蛋白為靶標的抗病毒藥物在靶標選擇上受到很大限制[2－4]。更為重要的是，病毒通過頻繁變異極易適應和逃避藥物施加的選擇壓力，解決病毒耐藥問題成為抗病毒藥物研究和開發(fā)的關鍵[3]。此外，由于不同種類的病毒蛋白結構差異較大，以病毒蛋白為靶的藥物很難實現(xiàn)廣譜[2－3]。近年來，宿主靶向和宿主－病毒聯(lián)合靶向策略成為抗病毒藥物研究的重要發(fā)展方向[5－9]?；诟咄坎《靖腥窘M學實驗和計算系統(tǒng)生物學方法構建病毒－宿主分子相互作用網絡，可以為從系統(tǒng)水平上辨識抗病毒藥物宿主靶標提供重要基礎。

1 宿主靶向抗病毒策略與宿主靶標辨識

由于病毒是嚴格的細胞內寄生生物，理論上可以通過抑制與病毒生存密切相關的宿主蛋白來達到抗病毒的目的。事實上，醫(yī)學遺傳學的相關研究已經為宿主靶向抗病毒策略提供了很多啟示，宿主細胞的基因在自然突變導致功能喪失后，往往可以使宿主避免某種病毒的感染。如HIV研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生趨化因子受體 5(C－C－motif receptor 5，CCR5)基因突變的人對HIV具有天然免疫性[10]，CCR5隨即成為抗HIV藥物的熱點宿主靶分子，其拮抗劑Maraviroc(馬拉維若)也通過了美國食品及藥物管理局的批準并用于臨床[11－12]。最新報道的 CCR5 拮抗劑 TD－0680 在抗病毒活性上比Maraviroc高出幾十倍，能廣泛用于抑制不同類型的人和猴艾滋病毒[13]。

宿主靶向抗病毒策略的一個突出優(yōu)勢是宿主細胞提供了遠比病毒豐富得多的候選藥物靶標。而且，由于人基因的突變率遠遠低于病毒基因，宿主靶向策略還可以比較好地解決耐藥問題[5]。除此之外，由于多種病毒可能會作用于相同的宿主蛋白，因此，宿主靶向藥物有可能具有廣譜抗病毒活性[2]。

宿主分子靶向的思想在抗痘病毒、皰疹病毒、肝炎病毒和蟲媒病毒藥物研究中也得到了應用。如靶向人ab1酪氨酸激酶的藥物Gleevec通過阻斷牛痘病毒A36R蛋白的磷酸化可以治療牛痘病毒感染[14]，靶向維生素K2轉移酶的抑制劑可治療丁型肝炎病毒(HDV)感染[15]，靶向組蛋白去乙?；窰DAC1可抑制 HIV的基因表達[16]，阻斷 eIF－2α的去磷酸化可抑制單純皰疹病毒(HSV)的復制[17]等等。特別是在丙型肝炎病毒(HCV)感染治療藥物的研究中，發(fā)現(xiàn)了一系列具有重要價值的潛在宿主靶標，如親環(huán)素[18]、人熱應激蛋白70[19]、載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G[20]、microRNA－122[21]等。

宿主靶向抗病毒策略要解決的一個重要問題是如何在大量的宿主細胞蛋白中選擇特異并低毒的抗病毒靶標。宿主靶標的辨識必須建立在對病毒－宿主相互作用網絡的全面和深刻認識上。各種組學和系統(tǒng)生物學的興起，為系統(tǒng)揭示病毒－宿主分子相互作用網絡提供了有力的實驗和理論工具，通過病毒感染轉錄組、蛋白質組、病毒－宿主蛋白相互作用組學、大規(guī)模RNAi文庫和計算系統(tǒng)生物學技術挖掘病毒感染、致病的關鍵宿主分子成為是近年來宿主靶標發(fā)現(xiàn)的主要手段。

2 病毒－宿主相互作用相關組學

近年來，病毒感染相關組學的研究揭示病毒和宿主在分子水平上存在廣泛而復雜的相互作用，引發(fā)了對于病毒－宿主分子相互作用網絡研究的關注和“病毒－宿主相互作用組學”的提出[8，22－25]。

2.1 病毒感染蛋白質組學

病毒感染蛋白質組學是隨著蛋白質組技術在病毒研究領域的應用而興起的，許多重要病毒如 HIV[26]，HCV[27]，SARS[28]，流感病毒[29]等感染前后的差異蛋白質組相繼被揭示。在研究方法上，從最初的2－D電泳到最近基于穩(wěn)定同位素標記的定量蛋白質組在病毒感染中的應用越來越廣泛[30]。Zhang等[28]利用細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)與質譜聯(lián)用的策略比較了SARS－CoV復制子細胞與其平行的 BHK21細胞的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)BAG3是抑制SARS－CoV RNA復制的關鍵宿主蛋白;Go等[31]應用ICAT技術分析被flock house virus感染的果蠅，共鑒定到1500個宿主蛋白，包括150個上調蛋白及66個下調蛋白。

考慮到病毒感染、復制過程的復雜性，上述這些靜態(tài)、單一的差異蛋白質組發(fā)現(xiàn)方法提供的信息有限，不能系統(tǒng)地反映病毒與宿主相互作用的動態(tài)變化，缺乏全景式描述。需要能夠分不同時間、不同組織和細胞的不同細胞器進行亞細胞定量蛋白質組學的縱深研究[32]。采用亞細胞分離蛋白不僅降低了樣品的復雜性、有利于提高質譜數據的可靠性，而且還可以提供許多蛋白移位穿梭的信息。最近有研究[29]利用高通量亞細胞動態(tài)定量蛋白質組學方法分析了流感病毒感染人原代巨噬細胞早期宿主細胞的反應，發(fā)現(xiàn)多達1000種蛋白表達出現(xiàn)差異并監(jiān)測到多種細胞質細胞核蛋白出現(xiàn)移位，發(fā)現(xiàn)P2X7、Src和溶酶體蛋白滲漏是流感病毒感染導致的炎癥反應的三個關鍵效應分子或通路，為流感病毒感染導致的炎癥反應提供了一個全景式網絡圖譜。

2.2 病毒－宿主蛋白相互作用組學

高通量蛋白質相互作用研究技術的進步為從系統(tǒng)水平上考察病毒－宿主分子相互作用奠定了重要實驗基礎。2006年以來，國際上一些知名刊物如Science，PNAS，MSB等先后報道了通過酵母雙雜交技術得到的 KSHV，VZV，EBV，SARS－Cov，HCV，DENV等重要病毒與宿主之間的蛋白相互作用圖譜[33－37]。

2.3 病毒感染依賴的關鍵宿主因子

大規(guī)模RNAi文庫是后基因組時代研究基因功能、特別是發(fā)現(xiàn)藥物靶標的重要工具。通過系統(tǒng)地沉默宿主基因，并觀察基因沉默后的病毒感染情況，可以發(fā)現(xiàn)病毒感染過程依賴的關鍵宿主蛋白，即關鍵宿主因子(essential host factor)。采 用 該 策 略 先 后 完 成 了 針 對 HCV[38－39]、DENV[40]、WNV[41]、流感病毒[42－44]、HIV[45－47]等重要病毒的大規(guī)模關鍵宿主因子篩選，為宿主靶標的挖掘提供了非常重要的線索。

2.4 病毒－宿主相互作用中的宿主miRNA

miRNA作為重要的轉錄后調控因子參與到人體發(fā)育、細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等諸多生物學過程。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的人編碼的miRNA前體已達721條。最近的研究表明，人編碼的miRNA在病毒－宿主相互作用中也扮演著重要角色。挖掘病毒感染和致病依賴的宿主miRNA對以miRNA及其調控分子為靶的抗病毒藥物設計具有重要的意義。宿主miRNA參與的病毒－宿主相互作用有多種模式。

首先，作為機體抗病毒免疫反應的重要補充，宿主編碼的一些miRNA可以直接靶向病毒，并在病毒感染的早期發(fā)揮重要的抗病毒作用。Lecellier等[48]預測并證實了人類泡沫病毒基因組開放閱讀框架2中的一個區(qū)域可能是人源miR－32的靶標，miR－32基因的表達可有效的抑制人類泡沫病毒的復制。研究還發(fā)現(xiàn)[49]過表達的miR－199a*可以顯著的降低HCV－1b和HCV－2a的復制，并且其靶向的5'UTR區(qū)域在所有HCV基因型中是高度保守。Hariharan等[50]采用一致性得分的方法對靶向HIV的miRNA的進行了預測，發(fā)現(xiàn)了5種人源miRNA可以靶向病毒的關鍵基因，分別是:hsa－mir－29a 和 29b 可以靶向 nef 基因，hsa－mir－149 靶向vpr基因，hsa－mir－378 靶向 env 基因，hsa－mir－324－5p 靶向vif基因。這是首次報道可以靶向 HIV基因的人源miRNA的存在，它們可能在延緩HIV感染中起到非常重要的作用。

其次，病毒可以通過調節(jié)人源miRNA的表達可以廣泛調節(jié)下游靶基因的表達水平，比如增加利于自身復制的聚合酶的表達，減少對自身不利免疫因子的表達。由于miRNA在轉錄水平即可發(fā)揮調控功能，因此病毒對宿主miRNA的調控有利于其實現(xiàn)對宿主細胞狀態(tài)的快速、高效調節(jié)，這一作用模式可能廣泛存在于各種病毒中，它的闡明對于理解病毒如何利用自身有限的基因組調節(jié)人體細胞復雜的調控網絡具有重要意義。這種模式已經在HIV中得到了證實[51]，在 HIV 感染過程中，人源的 miR－17－5a和 miR－20a均被下調表達，從而導致兩者在體內的靶標PCAF表達增加，而PCAF恰好是對HIV的感染有重要作用的Tat的輔助因子，使HIV的感染得到了增強。在病毒感染過程中常伴隨著人體細胞中一系列基因的上調和下調，這些基因的產物又會影響其他基因的表達，最終引起細胞功能狀態(tài)的改變。

此外，宿主miRNA可能與干擾素的抗病毒作用有密切關系。干擾素具有抗病毒的作用早已為人知曉，但其具體機制卻仍然沒有完全揭示，目前的研究認為干擾素是通過調節(jié)一系列細胞因子發(fā)揮抗病毒的作用[52－53]。Pedersen等[54]則發(fā)現(xiàn)干擾素的抗病毒作用與miRNA有密切關系，干擾素可引起人細胞內一系列miRNA的表達水平發(fā)生顯著變化，其中5個miRNA在HCV的基因組中有相應的作用靶點，用它們的模擬物處理HCV感染細胞重現(xiàn)了干擾素作用的效果，而用反義寡核苷酸對干擾素產生的miRNA進行中和后則使干擾素的抗病毒效果顯著降低。這些結果表明，干擾素可發(fā)動具有抗病毒作用的miRNA的表達而發(fā)揮直接的抗病毒作用，miRNA在干擾素作用機制中可能發(fā)揮著核心的作用，不過干擾素是否對其他病毒有類似的作用機制還有待于進一步的證實。

3 病毒－宿主分子相互作用網絡分析

隨著實驗數據的快速積累，病毒－宿主分子相互作用呈現(xiàn)出越來越復雜的趨勢，通過簡單的邏輯分析很難把握這種復雜性。在此背景下，采用計算系統(tǒng)生物學方法構建和分析病毒－宿主分子相互作用網絡、辨識病毒感染的關鍵宿主分子和通路成為重要的研究方向。

3.1 病毒－宿主分子相互作用的生物信息資源

在病毒－宿主分子網絡方面的兩個專業(yè)數據庫是VirHostNet[55]和 VirusMINT[56]。另外，在病原微生物和宿主相互作用數據庫 PHI－base[57]和 PHIDIAS[58]中，也包含了部分病毒－宿主分子相互作用數據。

VirHostNet是目前比較全面的綜合性病毒－宿主分子相互作用數據庫，其數據部分來自人工的文獻挖掘和校對，部分來自其他相關數據庫，內容包含了病毒自身蛋白質之間、病毒－宿主蛋白質之間及宿主自身蛋白質之間三部分的相互作用信息，共涉及7個病毒類、51個病毒科、222種病毒的1660個病毒蛋白。其中，病毒－人之間的蛋白相互作用共5207對，包含2189個人的蛋白和675個病毒蛋白，涉及31個病毒科、180種或亞種病毒。

通過對VirHostNet中收集的數據進行初步分析可以發(fā)現(xiàn)，當前對病毒的研究數據主要集中在雙鏈DNA病毒、逆轉錄病毒、單鏈RNA病毒這三類病毒，其相關數據占數據庫總數的90%以上;而對雙鏈RNA病毒和Delta病毒的研究較少，相關數據僅占總數的0.3%。VirHostNet中的數據存在較大偏性，HIV，HCV，HPV，AAV，HB等被研究較多病毒的相關數據占了絕大多數，在進行大范圍分析時需要進行統(tǒng)計學上的校正。

3.2 基于基因表達譜構建病毒感染激活網絡

近年來，將動態(tài)的基因表達譜數據和靜態(tài)的蛋白質相互作用網絡進行整合分析的方法得到了快速發(fā)展，這種整合分析可以為蛋白相互作用網絡加上時空約束，更加適合分析具體的生物醫(yī)學問題。目前在 GEO[59]，ArrayExpress[60]等數據庫中存儲了大量病毒感染相關的基因表達譜數據，利用這些表達譜數據，結合人蛋白相互作用網絡，可以通過計算手段快速構建病毒感染激活的宿主蛋白網絡。

李非等[61]基于該思路提出了一種病毒感染激活子網構建方法，該方法融合了基因表達的差異性和相關性信息，采用了模擬退火迭代搜索算法，能夠在已知的宿主蛋白質相互作用網絡中辨識高功能相關度的病毒感染激活子網。該算法可以有效避免僅考慮基因表達差異性所引入的偏差，揭示了高相關性低表達差異基因在相關通路中的關鍵性作用。應用該算法構建HIV感染激活子網，經過4次迭代后，子網中有39%為文獻報道的HIV相關分子，證明了算法的有效性。

3.3 大范圍病毒－宿主蛋白相互作用網絡分析

為了挖掘病毒－宿主蛋白相互作用網絡中蘊含的一般規(guī)律，一些研究將各種代表性病毒和宿主的相互作用集成起來，在整體水平上考察病毒－宿主分子相互作用網絡的各種性質。

Dyer等[62]通過對病毒－宿主蛋白相互作用網絡的拓撲分析發(fā)現(xiàn)，與病毒感染密切相關的宿主蛋白多為網絡中的“集線器(hub)分子”和“瓶頸(bottleneck)分子”。從復雜網絡的角度看，這些結果預示病毒對宿主分子網絡具有很強的影響乃至控制能力。從功能上看，病毒所涉及的宿主分子大多集中在細胞周期、細胞死亡、核轉運等與病毒生活周期密切相關的通路上。Navratil等[62]對病毒－宿主蛋白相互作用網絡的靜態(tài)拓撲和虛擬擾動分析不僅得到了類似的結果，而且通過將病毒－宿主蛋白相互作用網絡與疾病相關基因整合，發(fā)現(xiàn)了病毒感染和許多非傳染病疾病之間的廣泛聯(lián)系。

4 挑戰(zhàn)與展望

與病毒－宿主蛋白相互作用數據的積累相比，以此為對象的系統(tǒng)生物學研究工作還非常薄弱，已發(fā)表的結果大多是屬性關聯(lián)分析和靜態(tài)拓撲分析，對病毒感染機制和宿主靶標發(fā)現(xiàn)的指導價值還不夠。

病毒和宿主構成了復雜的生命體系，病毒的生存策略不僅體現(xiàn)在病毒－宿主蛋白相互作用網絡的靜態(tài)圖譜上，更蘊含于這一高度時空依賴的復雜網絡的動力學行為中。但目前對于病毒－宿主蛋白相互作用網絡動態(tài)模型及其應用方面的研究還非常欠缺。從本質上講，病毒蛋白與宿主蛋白發(fā)生相互作用取決于能否通過這種作用將網絡從感染前的正常狀態(tài)轉換為感染后更有利于自身生存的疾病狀態(tài)，而不取決于宿主蛋白在網絡中的拓撲性質。與病毒蛋白直接作用的宿主蛋白表現(xiàn)出來的拓撲偏性是其動力學性質的一種折射。理想的宿主靶標應該是能夠通過對其施加局部控制將網絡由感染的疾病狀態(tài)扭轉為正常狀態(tài)。因此，從系統(tǒng)生物學的角度看，宿主靶向抗病毒策略在本質上就是針對病毒－宿主蛋白相互作用網絡的控制策略，而這種控制策略的獲得必須基于對病毒－宿主蛋白相互作用網絡動力學行為的深入揭示。

從最近報道的系統(tǒng)生物學研究進展上看，將動態(tài)模型引入分子相互作用網絡可以得到一些對于藥物開發(fā)具有重要指導意義的結果，這些工作將為病毒－宿主分子相互作用網絡動態(tài)模型的構建和應用提供了重要參考，計算分析將在病毒－宿主相互作用研究和宿主靶標發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮更加重要的作用。

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