高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法用于單胺氧化酶抑制劑抑制效果的評(píng)價(jià)

王珊珊，馬培翔

（1.山東省分析測(cè)試中心大型精密儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南 250014；2.北京理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京 100081）

單胺氧化酶（MAO, EC 1.4.3.4）是存在于細(xì)胞線粒體外膜上的，含有硫氫基的一種黃素蛋白[1]。其在體內(nèi)的主要功能是催化內(nèi)源性和外源性單胺類(lèi)物質(zhì)（如5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素等）的代謝[2]。在MAO的作用下，單胺類(lèi)物質(zhì)被氧化而產(chǎn)生脫氨基作用[3]：

單胺類(lèi)物質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中主要以神經(jīng)遞質(zhì)的形式存在，MAO通過(guò)氧化脫胺作用調(diào)節(jié)這些單胺類(lèi)物質(zhì)的含量，從而起到調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)代謝的作用，因此MAO活力與抑郁癥和許多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病有關(guān)，如帕金森癥，老年癡呆癥和抑郁癥等，對(duì)其抑制劑的研究一直是治療相關(guān)疾病的熱點(diǎn)。

由于單胺氧化酶可以催化犬脲胺（Kynuramine）發(fā)生反應(yīng)（如圖1所示）[4]。生成熒光物質(zhì)4-羥基喹啉（4-Hydroxyquinolin，4-HQ） ，因此可利用HPLC－熒光檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)4-HQ生成量的變化，從而進(jìn)一步得出MAO酶抑制劑的抑制效果。

本文在實(shí)驗(yàn)室條件下，利用從鼠肝中提取的單胺氧化酶，檢測(cè)抑制劑的抑制效果，與液體閃爍計(jì)數(shù)等其它方法相比，方法簡(jiǎn)單安全，易于操作，穩(wěn)定性好且靈敏度高。

圖1 MAO催化Kynuramine的反應(yīng)機(jī)理

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

甲酸銨（分析純，北京市旭東化工廠），甲酸（色譜純，迪馬公司），Kynuramine（Sigma公司），4-Hydroxyquinolin（Sigma公司），Triton X-100（北京拜爾迪生物公司），Wistar大鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2 色譜條件

Agilent 1100系列四元泵和自動(dòng)進(jìn)樣裝置；Waters 474熒光檢測(cè)器；色譜柱：ZORBAX ECLIPSE XDB-C18( 2.1×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇：0.1%甲酸銨水溶液(25:75, v/v)，進(jìn)樣量2 μL，流速0.2 mL/min，室溫；激發(fā)波長(zhǎng)：315 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：380 nm。

1.3 單胺氧化酶的提取純化

1.3.1 單胺氧化酶的提取

單胺氧化酶的提取方法，參照文獻(xiàn)[5]，并作了調(diào)整，簡(jiǎn)述如下。Wistar大鼠頸椎脫臼處死，取其肝組織，在冰浴中用250mM的蔗糖溶液洗凈，然后將肝組織迅速剪碎轉(zhuǎn)入10mM的Tris·HCl 緩沖液（pH 7.5，mg:V=1:10 ）（含250mM的蔗糖和10mM的EDTA）中勻漿，；勻漿液在4℃，2000g的轉(zhuǎn)速下離心30min，取上清液17000g，4℃下離心20min，重新收集沉淀，用三蒸水洗滌離心沉淀三次，最后得到的沉淀就是粗提取單胺氧化酶。

1.3.2 單胺氧化酶的純化

單胺氧化酶的純化方法，參考文獻(xiàn)[6]稍作修改，簡(jiǎn)述之：將收集到的粗酶沉淀懸浮于添加了Triton-X100 (0.5% v/v)的Tris/EDTA緩沖液中勻漿，4℃；將勻漿液在4℃，160000g下離心40min,收集上清液。在上清液中加入65%（m/v）的硫酸銨，混懸后在4℃，4000g下離心30min，上層析出的黃色油狀物，即為純化后的單胺氧化酶，最后用PBS溶解收集。

1.4 單胺氧化酶的鑒定

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的方法對(duì)提純單胺氧化酶的分子量進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 單胺氧化酶分子量的鑒定

經(jīng)測(cè)定，所提取的單胺氧化酶的分子量約為56.6KD左右（如圖2所示），與文獻(xiàn)中精確測(cè)定的MAO分子量58KD相比，具有較好的一致性，因此從凝膠分析可初步證明得到了單胺氧化酶，而且從凝膠上的條帶可以看出，提純的效果比較好，雜蛋白比較少。

圖2 純化后的單胺氧化酶凝膠電泳圖

2.2 HPLC－熒光檢測(cè)器檢測(cè)4-HQ方法的建立

2.2.1 4-HQ標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

圖3 A為提取得到的單胺氧化酶的色譜圖，B為底物Kynuramine的色譜圖，A和B作為空白對(duì)照。C圖為4-羥基喹啉標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，D為單胺氧化酶與底物Kynuramine反應(yīng)的色譜圖。其中色譜條件：色譜柱ZORBAX ECLIPSE XDB-C18（ 2.1×150 mm, 5 μm，柱體積0.35mL）；流動(dòng)相：甲醇：0.6%甲酸銨水溶液=25：75；進(jìn)樣量2 μL；流速0.2 mL/min；檢測(cè)器為WATERS-474熒光檢測(cè)器，EX：315nm；EM：380nm；SSC-982數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

在1~8μmol·L-1之間均勻取點(diǎn)，將4-羥基喹啉（4-HQ）標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣得到的峰面積和濃度的關(guān)系，用最小二乘法經(jīng)線性回歸，得峰面積（A）與濃度（C）的關(guān)系曲線的回歸方程式為：

相關(guān)系數(shù) R2 = 0.9969。在該關(guān)系曲線上選取濃度為2 μmol·L-1，5 μmol·L-1， 8 μmol·L-1三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行精密度的測(cè)量，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.84%（n=5），經(jīng)日間精密度的測(cè)定結(jié)果，三個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.15%，2.45%，2.35%（n=5）。

2.2.2 酶反應(yīng)時(shí)間的確定

為了便于對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，以從Wistar大鼠肝臟中提取到的MAO為研究對(duì)象，考察了120 min內(nèi)酶的反應(yīng)產(chǎn)物4-HQ與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，用最小二乘法將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得到120 min內(nèi)產(chǎn)物4-HQ濃度（C）與反應(yīng)時(shí)間（t）的方程為：

相關(guān)系數(shù)R2＝0.9939，由此可以看出，在120 min內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的生成量是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈線性增加，在能滿足檢測(cè)需要的條件下，為了盡量縮短反應(yīng)時(shí)間，選定60 min作為實(shí)驗(yàn)中酶反應(yīng)的時(shí)間。

2.3 經(jīng)典抑制劑抑制效果的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)選用治療精神疾病的常用藥物帕吉林(優(yōu)降寧，pargyline) 和氯吉蘭(clorgyline)作為研究對(duì)象，考察方法的可靠性。我們將一系列不同濃度的藥物加入酶反應(yīng)體系中，將檢測(cè)到的4-HQ濃度代入關(guān)系式（3）中計(jì)算抑制百分比(C0為對(duì)照組濃度，C為反應(yīng)樣品濃度)：

圖4 柱外酶的反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系

圖5 Pargyline和Clogyline的濃度與抑制百分比的關(guān)系圖

經(jīng)過(guò)HPLC－熒光檢測(cè)器檢測(cè)，得到如圖5所示的抑制百分比和藥物濃度之間的關(guān)系。

從圖5中可以看出，隨著抑制劑濃度的增大，抑制百分比也逐漸增大，Pargyline的抑制效果比Clogyline更好，且趨勢(shì)明顯，從而證明本文所建立的方法可用于MAO抑制劑的抑制效果的研究。

3 結(jié)論

HPLC-熒光檢測(cè)器檢測(cè)單胺氧化酶抑制劑活性的方法與傳統(tǒng)的液體閃爍計(jì)數(shù)方法相比，儀器較為簡(jiǎn)單，分析速度快，重現(xiàn)性好，對(duì)于單胺氧化酶抑制劑的進(jìn)一步研究提供高效和便捷的評(píng)價(jià)工具。

[1] 裘月 等，中國(guó)藥學(xué)雜志，1994，29(10): 596~599

[2] Johnston J P.Biochem Pharmacol , 1968 , 17 (7) : 1185~1197

[3] Olanow C W.Adv Neurol, 1993, 60: 666

[4] Herbert Weissbach et.al., J.Biol Chem, 1960, 235:4

[5] M.J.Schwarz et al., Biochemistry and Behavior 2003, 75:627~633

[6] Kathrin Dittmann et al, Phytochemistry.2004, 65:2885~2891