一種新的提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及對(duì)提取細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

張校通，海 泉，胡忠國，申重陽，趙令卉，王小燕，陳靜嫻，鄭榆坤*

（1.成都清科生物科技有限公司干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，成都 610000；2.重慶卓馳生物科技有限公司，重慶 400700）

近年來干細(xì)胞的應(yīng)用越來越廣泛[1]。人們對(duì)它的研究也越來越深入。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，簡稱MSCs）是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSCs最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞( Adipose-derived stem cells, ADSCs) 是一種來源廣泛、含量豐富、分離簡單的間充質(zhì)干細(xì)胞，屬于成體干細(xì)胞的一種，被認(rèn)為是脂肪組織中具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是具有多向分化的干細(xì)胞[2]。研究證實(shí)來自脂肪組織的干細(xì)胞在培養(yǎng)后也比其他來源的干細(xì)胞生長得均勻[3]。脂肪干細(xì)胞在特定刺激因素下可分化為脂肪細(xì)胞，且經(jīng)過長時(shí)間的培養(yǎng)，仍可維持此種分化能力[4]。因此，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞被廣泛的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、美容方面。

膨脹液是在1000 ml生理鹽水中加入20 ml利多卡因、1 ml腎上腺素和32萬單位慶大霉素。鹽水中加入利多卡因的作用是起到局部注射麻醉的作用。而加入腎上腺素的作用是使血管擴(kuò)增和皮膚、黏膜的血管縮小，其與利多卡因一起使用可以起到止血的作用。

目前，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離主要來源于抽取的脂肪組織。相關(guān)的論文及已有的專利申請(qǐng)，目前都是從脂肪組織中提取，例如：一種脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法；人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法；一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其應(yīng)用；從脂肪組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法等。局部注射膨脹液是抽脂手術(shù)中常用的一種方法，該方法既可保證麻醉效果的確切性，又可使術(shù)中出血減少，術(shù)后疼痛減輕，在抽脂手術(shù)中得到廣泛的應(yīng)用。目前，還尚未有從膨脹液中分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道或?qū)＠?。通過研究，我們發(fā)現(xiàn)從膨脹液中也可以分離出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，分離間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增以及細(xì)胞特性鑒定，結(jié)果證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均符合國際標(biāo)準(zhǔn)，該方法為提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提供了一個(gè)新的途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

主要儀器及耗材：離心管（Corning）；移液管（Corning）；細(xì)胞濾網(wǎng)（BD）；移液槍（BRAND）；離心機(jī)（湖南湘麓）；培養(yǎng)瓶（Corning）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO）；流式細(xì)胞儀(BD）。

主要試劑：250ml生理鹽水（太極藥業(yè)，H50021610）；利多卡因（上海復(fù)星朝暉藥業(yè)，0.2g*10ml，H31021073）；腎上腺素（杭州民生藥業(yè)，1mg/ml，H33021601）；紅細(xì)胞裂解液(Solarbio，R1010)；DMEM (HyClone，SH30243.01B)；間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(stem cell)；抗體(BD)。

1.2 方法

1.2.1 抽取含脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的膨脹液

抽脂前向所要抽取部位灌注過量膨脹液，然后將抽脂過程中獲取的脂肪與膨脹液混合液約500 ml置于室溫下放置10 min，待脂肪與膨脹液完全分離后，移液槍抽取下層紅色液體，即為含有脂肪干細(xì)胞的膨脹液。

1.2.2 膨脹液的處理

將收集到的膨脹液放入離心機(jī)以1500 rpm離心5 min。離心吸取棄掉離心管上面部分的液體，收集沉淀。每管用3 ml PBS液懸浮，按1:2的體積比加入紅細(xì)胞裂解液，室溫靜置5 min，以1200 rpm離心3 min，棄上清液取沉淀備用。

1.2.3 脂肪干細(xì)胞的分離

將所得沉淀物用低糖DMEM培養(yǎng)基懸浮，細(xì)胞濾器過濾,然后將過濾液體以1200 rpm離心3 min，沉淀即為要獲取細(xì)胞。再加入DMEM（不含血清）重復(fù)以上的操作洗滌3次，去除紅細(xì)胞裂解液，得到細(xì)胞即為目的細(xì)胞。

1.2.4 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)

將獲取細(xì)胞接種至75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入10 ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，48 h換液繼續(xù)培養(yǎng)。

2 兩種分離方法得到的干細(xì)胞比較

由圖1我們可以看到，膨脹液來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，光鏡下貼壁生長，呈長梭形，核大，內(nèi)含1～2個(gè)核仁。隨細(xì)胞數(shù)量增加，可呈魚群狀排列，有極性細(xì)胞數(shù)量非常多時(shí)可融合成片。

圖1 膨脹液來源的脂肪干細(xì)胞 （×100）Fig.1 Adipose-derived stem cells isolated from tumescent liquid.（×100）

如表1、圖2、圖3所示，對(duì)從膨脹液及脂肪組織來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行免疫表型CD73，CD90，CD105和CD45，CD34，CD11b，CD19，HLA-DR檢測(cè)。結(jié)果顯示，細(xì)胞傳至第五代時(shí)，檢測(cè)CD73，CD90，CD105均呈高表達(dá)，而CD45，CD34，CD11b，CD19，HLA-DR均呈現(xiàn)低表達(dá)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膨脹液來源脂肪干細(xì)胞干性標(biāo)記物Fig.2 The expression of Adipose-derived stem cell surface markers detected by flow cytometry.Stem cells were isolated from tumescent liquid.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂肪組織來源脂肪干細(xì)胞干性標(biāo)記物Fig.3 The expression of Adipose-derived stem cell surface markers detected by flow cytometry.Stem cells were isolated from adipose.

表1 細(xì)胞傳至第五代時(shí)免疫表型檢測(cè)結(jié)果Table 1 The cells to the fifth generation immune to phenotype test results

通過對(duì)從膨脹液及脂肪組織來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)分離自膨脹液的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量雖然明顯低于與等體積脂肪組織來源干細(xì)胞，但細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)表明，但其增殖速度較快，生長至第8天時(shí)，密度已基本等同于脂肪組織來源干細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)也無。明顯差異。按照相同的操作方法分離5人次脂肪抽吸過程中獲得的膨脹液，都得到了脂肪干細(xì)胞，說明此方法穩(wěn)定可靠。

圖4 細(xì)胞生長曲線比較兩種方法分離的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性Fig.4 Cells growth curve displayed the comparison of cell proliferation activity between stem cells isolated from tumescent liquid and adipose tissue.

由圖5的a、b、c圖我們可以看到，對(duì)膨脹液來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨和成軟骨三向分化的誘導(dǎo)以后，我們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可以向這三個(gè)方向分化。這與國際干細(xì)胞協(xié)會(huì)規(guī)定的間充質(zhì)干細(xì)胞定義相符。因此，分離細(xì)胞確為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖5 膨脹液中提取脂肪干細(xì)胞3向分化（×50）(a) 成骨分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果；（b）成脂分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(c) 成軟骨分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Multi-directional differentiation properties of stem cells isolated from tumescent liquid（×50）(a) osteogenic differentiation;（b）adipocytic trans-differentiation; (c)chondrogenic differentiation

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等組織細(xì)胞，并具有體外增生與多從分化的能力，能運(yùn)用于器官與組織的再生與修復(fù)。已有研究利用脂肪干細(xì)胞和支架成功地修復(fù)了鼠、兔、犬骨缺損模型中的缺損[5-7]。目前經(jīng)研究可以取得間充質(zhì)干細(xì)胞的來源有脂肪、臍帶、骨髓、乳牙等。研究指出，從臍帶和脂肪中取得的間充質(zhì)干細(xì)胞，作為未來細(xì)胞療法、組織工程、再生醫(yī)學(xué)的材料，其重要性及未來的發(fā)展?jié)摿εc日俱增。

脂肪組織來源干細(xì)胞是位于脂肪基質(zhì)內(nèi)的一種細(xì)胞。脂肪來源的基質(zhì)細(xì)胞，是繼骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，在成體干細(xì)胞中具有重要作用的一類干細(xì)胞，具有多向分化潛能。在適宜的條件下，可以定向分化為多種細(xì)胞,如脂肪、心肌、平滑肌、骨骼肌、軟骨、骨、神經(jīng)、血管、肝臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞等, 因此, 受到越來越多的關(guān)注[8-20]。并且脂肪干細(xì)胞有望成為脂肪組織工程構(gòu)建的優(yōu)良源細(xì)胞，并與生物支架材料有效結(jié)合[21-22]。隨著對(duì)其特性及分子機(jī)制的深入研究，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程和臨床醫(yī)學(xué)的研究中將極具潛力[23-24]。常規(guī)實(shí)驗(yàn)分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法是從脂肪組織中分離得到。作者經(jīng)過多年的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，從膨脹液中也分離得到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。雖然相同體積的膨脹液和相同體積的脂肪組織比較，脂肪組織提取到的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞要多一些。但經(jīng)過后期的細(xì)胞培養(yǎng)以后，細(xì)胞的數(shù)量逐漸接近。經(jīng)過細(xì)胞免疫表型檢測(cè)，兩種來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表型變化相同。而且通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以向成脂、成骨和成軟骨三向分化。這與國際干細(xì)胞協(xié)會(huì)規(guī)定的間充質(zhì)干細(xì)胞定義相符。因此，分離細(xì)胞確為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。所以本發(fā)明為提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取提供了新的來源。為提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞找到了新的途徑。為以后進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)的人員，提供了一個(gè)參考。

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