長期高糖導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)多巴胺儲量減少

彭 磊，謝冰潔*

（北京理工大學(xué)，北京，100081）

前言

糖尿病(diabetes)是一種與胰島素產(chǎn)生和作用異常相關(guān)、以高血糖癥為主要特征的代謝性疾病。糖尿病對神經(jīng)系統(tǒng)的影響是全身性的，可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)[1][2]。帕金森病是一種與年齡有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病因迄今不明。其主要的病理變化是黑質(zhì)致密部(DSN)的多巴胺(DA)能神經(jīng)元選擇性缺失及紋狀體多巴胺含量明顯減少，殘留神經(jīng)元胞漿中出現(xiàn)嗜酸性包涵體—Lewy小體[3]。導(dǎo)致帕金森病主要有遺傳因素和環(huán)境因素，遺傳因素不能完全解釋其臨床特征，而且臨床上有80%以上的患者為散發(fā)性，病因不明。流行病學(xué)調(diào)查顯示：喝井水、農(nóng)村生活史和殺蟲藥、除草劑等工業(yè)化合物的暴露是誘發(fā)PD的潛在危險因素。據(jù)文獻(xiàn)報道，臨床上在50、60年代糖尿病患者患帕金森病的患病率為73%，70年代為50%，90年代時為30.5%，而正常人患帕金森病的患病率僅為1%。行病學(xué)調(diào)查顯示：糖尿病患者比正常人得帕金森病的幾率要高83%以上[4]。尤其早期糖尿病，在沒有其他并發(fā)癥的時候，其患帕金森的的幾率是正常人的7倍[5]。糖尿病(diabetes)和帕金森癥是兩種世界性的，常見高發(fā)的慢性病，對人類的生命健康威脅極大。流行病學(xué)研究提示我們糖尿病這種代謝系統(tǒng)疾病可能作為散發(fā)性PD患者的一個重要原因。多巴胺是腦內(nèi)正常的神經(jīng)遞質(zhì)。多巴胺在由酪氨酸羥化酶合成后儲存于突觸囊泡，胞吐作用釋放至突觸間隙，部分通過DAT重攝取入胞質(zhì)由VMAT2轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡，避免DA在胞質(zhì)內(nèi)的過氧化，維持DA的穩(wěn)態(tài)和循環(huán)利用[6][7]。而在帕金森病的晚期,有一個特征就是黑質(zhì)紋狀體通路的多巴胺含量減少。所以本研究以SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞模型，研究長期高葡萄糖的情況下,細(xì)胞內(nèi)多巴胺的含量.

2 材料與方法

2.1 實驗試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基： Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM），美國 Gibco 公司；胎牛血清：美國 Gibco 公司；青霉素、硫酸鏈霉素、胰蛋白酶：北京拜爾迪公司；5-氟苯基色譜分離柱HS F5 column（5μm, 250 mm×4.6 mm）：美國Discovery?公司；庫倫陣列高效液相色譜-電化學(xué)檢測系統(tǒng) CoulArray?Multi-Channel ECD system：美國 Esa公司；多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品：美國 Sigma公司.

2.2 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y（人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞）由本實驗室保藏。使用含 DMEM高糖培養(yǎng)基 90 %，胎牛血清10 %的培養(yǎng)液，于 37℃二氧化碳濃度 5 %濕度90%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 多巴胺及其代謝產(chǎn)物的檢測

離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，按照3個大皿200μ 的比例將細(xì)胞重懸于含有蛋白酶抑制劑的PBS 溶液中。使用細(xì)胞超聲破碎儀以 2s on，1s off的條件破碎 40秒，取10μL破碎液進(jìn)行蛋白濃度測定，其余破碎液以 10：1的比例加入 0.1M 高氯酸除蛋白，樣品于 4℃下以17,000 g離心20分鐘，取上層清液，經(jīng)0.22μm 水系濾膜過濾后作為色譜檢測樣品。利用HPLC-ECD 檢測色譜條件：流動相 45mM 磷酸氫二鈉、35mM 檸檬酸、0.13mM Na2EDTA、8% 乙腈 ， pH 值 4.0 ，流速 1mL/min 進(jìn)樣量 40μL 檢測器電勢 -50、50、300、350mV

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本研究中所有實驗數(shù)據(jù)利用 Microsoft Office Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。平行處理的樣本進(jìn)行平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤計算后做圖，并以誤差線的形式表示標(biāo)準(zhǔn)誤。使用 SSPS 13.0軟件進(jìn)行t 檢驗（平均值的成對二樣本分析）以分析顯著性，*代表 P﹤0.05，**代表P﹤0.01。所有給出顯著性分析的實驗中，重復(fù)樣本數(shù) n均≥3。

3 實驗結(jié)果

3.1 多巴胺含量的檢測

本實驗以SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞模型,以200mmol/L葡萄糖處理SH-SY5Y模型細(xì)胞48小時，收集細(xì)胞,破碎細(xì)胞,用HPLC-ECD檢測細(xì)胞內(nèi)多巴胺的含量,結(jié)果如圖一:

圖1 細(xì)胞內(nèi)多巴胺含量的檢測綠線是對照組，藍(lán)線是高糖處理組。紅線為多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 細(xì)胞內(nèi)多巴胺含量統(tǒng)計圖

從圖2中可以看出：高糖處理下，SH-SY5Y細(xì)胞中多巴胺儲量下降。多巴胺是腦內(nèi)正常的神經(jīng)遞質(zhì),由酪氨酸羥化酶合成后儲存于突觸囊泡，胞吐作用釋放至突觸間隙，部分通過DAT重攝取入胞質(zhì)維持DA的穩(wěn)態(tài)和循環(huán)利用[6][7]。而在帕金森病的晚期,有一個特征就是黑質(zhì)紋狀體通路的多巴胺含量減少。長期高葡萄糖的情況下,細(xì)胞內(nèi)多巴胺的含量減少,提示我們糖尿病患者有可能通過減少多巴胺能神經(jīng)元中多巴胺含量增加患帕金森病的風(fēng)險.

4 討論

在帕金森病的病因調(diào)查當(dāng)中,環(huán)境因素成為散發(fā)性PD的主要原因, 人在外界環(huán)境作用下，如：化學(xué)藥物、環(huán)境污染、物理損傷、情緒壓力等，會產(chǎn)生系列的應(yīng)激反應(yīng)，如：氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激能夠?qū)е翷PO并產(chǎn)生一系列的小分子活性醛（如甲醛、乙醛、丙二醛、丙酮醛等），糖化反應(yīng)（Glycation）或氨基酸氧化（amino acide oxidation）都是小分子活性醛可能的來源[8][9]?；钚匀┡cDA作用能夠在腦內(nèi)生成CAIQs，合成過程可能包括合成酶催化和Pictet-Splender縮合反應(yīng)兩種途徑[10][11]。它可以聚集在線粒體上抑制ComplexⅠ的活性，造成線粒體功能障礙，ATP合成降低和能量危機(jī)。最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡。

正常人患帕金森病的患病率僅為1%。行病學(xué)調(diào)查顯示：糖尿病患者比正常人得帕金森病的幾率要高83%以上[4]。尤其早期糖尿病，在沒有其他并發(fā)癥的時候，其患帕金森的幾率是正常人的7倍[5]。我國糖尿病人群的構(gòu)成以2 型糖尿病為主，占糖尿病人群的90% 以上。2 型糖尿病的病因非常復(fù)雜，涉及到各種遺傳因素和環(huán)境因素以及它們間的相互作用。

研究發(fā)現(xiàn) ：與正常個體相比 ,患者體內(nèi)丙酮醛濃度明顯增高.在藥物進(jìn)行治療后，雖然血糖有所降低，但那是丙酮醛的含量無法回到基線[12]。

本研究證明高糖長期處理下SH-SY5Y細(xì)胞中多巴胺儲量下降。糖尿病患者腦內(nèi)丙酮醛濃度明顯增高。黑質(zhì)致密部和紋狀體區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元區(qū)，由于神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的含量很高，丙酮醛是多功能團(tuán)羰基化合（DMCs）交聯(lián)儲存多巴胺的囊泡，使囊泡中的多巴胺游離出來，其又極易與含有氨基的多巴胺發(fā)生反應(yīng)， 破環(huán)了多巴胺的穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)多巴胺的儲量減少。

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