熒光金逆行標(biāo)記乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

李靜波， 徐尤學(xué)， 方家華， 張祖海 (長(zhǎng)江大學(xué)附屬荊州市第一人民醫(yī)院眼科， 荊州 434000;湖北省京山縣羅店醫(yī)院眼科;通訊作者，E-mail:zhangzuhai787@sina.com)

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞位于視網(wǎng)膜的內(nèi)層，是視網(wǎng)膜的第三級(jí)神經(jīng)元，其軸突組成視神經(jīng)，將視覺(jué)信號(hào)輸入大腦，在視覺(jué)通路中起著重要的傳導(dǎo)作用。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是青光眼以及視神經(jīng)炎等病變的靶細(xì)胞，最近發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜中少數(shù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞能夠合成感光蛋白，具備了自主感光的能力，被稱為自主感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞［1］，因此，研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的電生理特征具有重要的意義。初生的乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有較強(qiáng)的活性，適合做膜片鉗等電生理實(shí)驗(yàn)，在開(kāi)展電生理實(shí)驗(yàn)之前，需要分離并鑒定細(xì)胞。

熒光金是一種性質(zhì)穩(wěn)定的熒光示蹤劑，可用于視神經(jīng)、坐骨神經(jīng)等的標(biāo)記。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突在大腦上丘和外側(cè)膝狀體交換神經(jīng)元，其中大部分投射到上丘，熒光金注射到上丘后，通過(guò)軸漿逆行運(yùn)輸，大約24 h后到達(dá)視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體被標(biāo)記，在熒光顯微鏡下可進(jìn)行觀察。國(guó)內(nèi)已有熒光金逆行標(biāo)記成年大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的報(bào)道［2］，但沒(méi)有標(biāo)記并分離乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的報(bào)道。本研究中，我們擬建立熒光金逆行標(biāo)記乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法。

圖1 顯微鏡下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)Fig 1 The morphology of retinal ganglion cells under microscope

1 材料和方法

1.1 乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逆行標(biāo)記 SD大鼠購(gòu)自長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，4%熒光金注射液購(gòu)自Biotium公司。取出生1 d的SD大鼠乳鼠10只，按照350 mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。麻醉成功后，用碘伏消毒頭頂皮膚，沿大鼠頭頂正中線，使用消毒器械從前向后剪開(kāi)頭皮，暴露前囟和后囟。以后囟為坐標(biāo)，后移0.5 mm，旁開(kāi)1 mm，對(duì)應(yīng)雙側(cè)上丘核。用1 ml注射器針頭刺穿顱骨，然后使用5 μl的平頭微量注射器，向下刺入3 mm，注射熒光金注射液1 μl，停留3 min拔出，一側(cè)注射完畢后再注射另一側(cè)，雙側(cè)均注射完畢后用5－0絲線縫合皮膚，碘伏消毒。麻醉復(fù)蘇后，繼續(xù)母乳喂養(yǎng)。

1.2 提取視網(wǎng)膜進(jìn)行體外培養(yǎng) 在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逆行標(biāo)記后第4天，即乳鼠出生后5 d，用75%酒精全身噴灑乳鼠消毒，脫臼處死。取出眼球，放入裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于冰塊上。解剖顯微鏡下沿眼球赤道部環(huán)形剪開(kāi)眼球，取出視網(wǎng)膜。所有眼球的視網(wǎng)膜都取出后，將視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移到0.125%的胰酶中，放置到37℃培養(yǎng)箱中消化10 min，輕輕吹打，去除較大的組織塊。加入含20%胎牛血清的F12培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min，吸出離心管上面的液體，加入含20%胎牛血清的F12培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度后種植到培養(yǎng)皿中，放入含5%濃度二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液一次。

1.3 顯微鏡下觀察被標(biāo)記的細(xì)胞 在分離后7 d，21 d，使用Olympus IX71顯微鏡拍照，分別拍攝普通光及熒光圖片。熒光金的激發(fā)波長(zhǎng)為350－395 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530－600 nm。顯微鏡下見(jiàn)標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)出熒光。用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)分離后立即拍照的圖像進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。選取5張圖片，對(duì)細(xì)胞總數(shù)及被熒光金標(biāo)記的細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，取平均值，計(jì)算被熒光金標(biāo)記的細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比。

2 結(jié)果

視網(wǎng)膜用胰酶消化后，立即在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)混合培養(yǎng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞成球形，單細(xì)胞狀。有少量細(xì)胞被熒光金標(biāo)記，大約占細(xì)胞總數(shù)的0.34%(圖1A，1B，見(jiàn)第638頁(yè))。細(xì)胞培養(yǎng)1周后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞長(zhǎng)出軸突，胞體及軸突均有熒光(圖1C，1D，見(jiàn)第638頁(yè))。培養(yǎng)3周后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突變短，細(xì)胞膜光澤變暗，胞體有顆粒樣改變，仍可見(jiàn)胞體熒光，但細(xì)胞活性很差，核固縮，處于瀕死狀態(tài)。

3 討論

本研究顯示，通過(guò)向乳鼠大腦雙側(cè)上丘注射熒光金，可成功標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。在注射熒光金后4 d，提取視網(wǎng)膜細(xì)胞進(jìn)行體外混合培養(yǎng)，被標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在激發(fā)光照射后可發(fā)出熒光，此方法可用于鑒定視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

用熒光示蹤劑標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，常用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的計(jì)數(shù)，觀察視網(wǎng)膜受到損傷后細(xì)胞數(shù)目的變化，以及視神經(jīng)保護(hù)藥物的神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)研究中，常用的示蹤劑有熒光金，粒藍(lán)，Dil等;常用的模型包括高眼壓引起的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，以及眼內(nèi)玻璃體腔注射興奮性毒素如谷氨酸引起的興奮性損傷模型。我們?cè)鴪?bào)道，雙七他克林可以減少興奮性毒素引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少［3］。在這個(gè)視網(wǎng)膜興奮性模型中，我們使用成年的SD大鼠，依照大鼠腦立體定位圖譜［4］，向大鼠雙側(cè)上丘及外側(cè)膝狀體注射熒光金。上丘以前囟為零點(diǎn)，后移(6.8±0.2)mm，旁開(kāi)(1.6±0.2)mm;外側(cè)膝狀體以前囟為零點(diǎn)，后移(4.6 ±0.2)mm，旁開(kāi)(4.0 ±0.2)mm。在腦立體定位儀上注射藥物，注射深度上丘為(4.0±0.2)mm，外側(cè)膝狀體為(5.6 ±0.2)mm。

利用體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞做膜片鉗實(shí)驗(yàn)，需要使用剛出生不久的乳鼠細(xì)胞，這些細(xì)胞的活力強(qiáng)于成年大鼠細(xì)胞，但是需要鑒定。成年大鼠的顱骨表面投射坐標(biāo)適用于體重180 g以上的大鼠［4］，而乳鼠體重只有幾克，頭部很小，尚未發(fā)育成熟，成年大鼠的坐標(biāo)顯然不適合乳鼠，并且乳鼠也無(wú)法放置到腦立體定位儀上操作。我們依據(jù)多次在成年大鼠注射熒光金的經(jīng)驗(yàn)，確定乳鼠上丘的位置，位于后囟后0.5 mm，旁開(kāi)1 mm，深度3 mm。由于大部分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突在上丘交換神經(jīng)元，因此我們只標(biāo)記了上丘，沒(méi)有標(biāo)記外側(cè)膝狀體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示我們的定位是可行的。國(guó)外有報(bào)道，使用粒藍(lán)標(biāo)記乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但是，并沒(méi)有對(duì)標(biāo)記點(diǎn)的坐標(biāo)位置進(jìn)行描述［5］。

另外，我們的結(jié)果顯示被標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞占全部視網(wǎng)膜細(xì)胞的0.34%，這個(gè)結(jié)果與以前的報(bào)道基本一致［6，7］。其中一篇報(bào)道指出，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞占全部視網(wǎng)膜細(xì)胞的百分比低于1%［6］，而另一篇報(bào)道中，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞占比約0.5%［6］。我們的結(jié)果比0.5%還要低，可能有兩方面的原因:一是我們只標(biāo)記了上丘，沒(méi)有標(biāo)記外側(cè)膝狀體，一部分細(xì)胞漏掉了;二是我們無(wú)法使用腦立體定位儀，難以確保每次都注射到相同的位置，可能有的注射點(diǎn)有偏移。

總之，本研究建立了一種用熒光示蹤劑逆行標(biāo)記乳鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，可用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的鑒定，有助于膜片鉗等實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。

［1］ 曾強(qiáng)，何士剛.視網(wǎng)膜中的自主感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞［J］.生物物理學(xué)報(bào)，2011，27(5):387 －394.

［2］ 尹小磊，葉劍，陳春林.熒光金逆行標(biāo)記觀察正常大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及軸突［J］.標(biāo)記免疫分析與臨床，2006，13(4):218－220.

［3］ Zhang ZH，Liu YW，Jiang FG，et al.Bis(7)-tacrine protects retinal ganglion cells against excitotoxicity via NMDA receptor inhibition［J］.Int J Ophthalmol，2011，4:125 －130.

［4］ Paxinos G，Watson C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates［M］.4th ed.New York:Academic Press，1998:47.

［5］ Chen HS，Lipton SA.Mechanism of memantine block of NMDA-activated channels in rat retinal ganglion cells:uncompetitive antagonism［J］.J Physiol，1997，499(Pt 1):27 －46.

［6］ Kikuchi M，Tenneti L，Lipton SA.Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells［J］.J Neurosci，2000，20:5037 － 5044.

［7］ Shen S，Wiemelt AP，McMorris FA，et al.Retinal ganglion cells lose trophic responsiveness after axotomy［J］.Neuron，1999，23:285－295.