不同方法制備的PLGA－膠原復合支架對大鼠成肌細胞增殖活性的影響

鄒 蕊， 宋錦璘， 牛 林 (西安交通大學附屬口腔醫(yī)院正畸科， 西安 70004;重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院正畸科;西安交通大學附屬口腔醫(yī)院修復科)

細胞外基質(zhì)及其三維空間結(jié)構(gòu)不僅能夠提供細胞獲取營養(yǎng)、交換氣體、排泄廢物和生長代謝的微環(huán)境，同時，作為細胞內(nèi)及細胞間生物化學反應和信號轉(zhuǎn)導通路的發(fā)起者，它也是細胞賴以生長分化的物質(zhì)基礎，并控制著細胞的特異性分化和功能。越來越多的研究結(jié)果顯示，生長于三維基質(zhì)支架中的細胞，具有更接近于在體細胞的形態(tài)和功能。而近年來發(fā)展迅猛的組織工程技術，可在體外充分模擬細胞外基質(zhì)微環(huán)境，為進一步研究三維培養(yǎng)條件下細胞的生物學行為提供了新的技術手段。

圖1 PLGA－膠原支架的掃描電鏡觀察Fig 1 The morphology of PLGA-collagen scaffolds under scanning electron microscope

圖2 成肌細胞支架復合培養(yǎng)的倒置顯微鏡觀察(×200)Fig 2 The morphology of rat myoblasts cultured with the two PLGA-collagen scaffolds under inverted microscope(×200)

聚乳酸 －羥基乙酸(poly lactide-co-glycolide，PLGA)是一種在醫(yī)學及生物學領域被廣泛應用的生物高分子材料，具有十分優(yōu)越的生物相容性和生物降解性［1，2］，是組織工程技術中最為重要的支架材料之一。PLGA材料不僅具有良好的生物性能，而且制備成多孔支架材料后其物理化學性具很強的可調(diào)控性。根據(jù)支架材料的不同孔隙率及孔徑大小，能夠嵌入或攜帶各種細胞，從而模擬多種細胞存活的三維空間結(jié)構(gòu)，滿足培養(yǎng)多種細胞的需要，如成纖維細胞、平滑肌細胞、成肌細胞、成骨細胞等［3－7］。但單純的PLGA支架表面呈現(xiàn)較高的生物惰性和疏水性，將Ⅰ型膠原復合于PLGA支架表面，制備成PLGA－膠原復合生物支架能有效提高其細胞相容性［8］。本實驗通過骨骼肌細胞與PLGA－膠原生物三維支架的復合培養(yǎng)，評價不同方法制備的PLGA－膠原支架對細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 F12培養(yǎng)基、小牛血清購自美國Gibco公司，Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽［3－(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)－2，5-diphenyl-2H-tetrazoliumbro mide，MTT］購自美國 Sigma公司，分析純二甲基亞砜(dimethyl sulfone，DMSO)購自成都科龍化學試劑公司。

1.2 PLGA－膠原支架的制備 利用兩種不同的方法制備PLGA－膠原支架。方法一:以氯仿為溶劑，配制一定濃度的PLGA溶液，在電壓為15 kV、噴絲頭與接收屏的間距為6 cm、一定流速的條件下進行靜電紡絲，收集、干燥后獲得具有多孔三維立體結(jié)構(gòu)的PLGA纖維支架膜，厚度約為200－300 μm。方法二:將PLGA充分溶解后，分別采用孔徑為60－80 μm的致孔劑制成PLGA膜。干燥后，使用溶劑反復沖洗，使粒子洗出，形成多孔結(jié)構(gòu)。將0.5 gⅠ型膠原蛋白溶解于100 ml冰醋酸中，制成0.5%的膠原溶液。將PLGA支架浸泡于膠原溶液中4 h，取出干燥。PBS液反復沖洗3－4次，去除殘余冰醋酸，以免影響細胞生長。干燥消毒后與細胞進行復合培養(yǎng)。

1.3 大鼠成肌細胞在PLGA－膠原支架上的接種

本實驗采用Blau法，選擇出生1－2 d的SD大鼠乳鼠進行頜面部骨骼肌細胞的原代培養(yǎng)，獲得大鼠成肌細胞［9］。實驗共分為三組:靜電紡絲組、粒子洗出組和空白對照組。將已制備的PLGA－膠原支架材料經(jīng)低溫等離子干燥消毒后剪成約1 cm2左右小塊，分別置于24孔板的孔內(nèi)。將第3代大鼠成肌細胞以1×105/ml密度接種于PLGA－膠原支架上，每孔1 ml，以空白孔設為對照組，亦分別加入1 ml細胞懸液。分別于培養(yǎng)1，2，3，5，7 d進行 MTT檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析 測量獲得的各組試驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件計算均值及標準差，以空白組為對照，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種支架分別與成肌細胞復合培養(yǎng)的形態(tài)學觀察 掃描電鏡觀察可見，溶液澆鑄－粒子洗出法制備的PLGA支架表面呈現(xiàn)大小不等的圓形或橢圓形孔隙，直徑約20－100 μm不等，不能完全實現(xiàn)孔孔相通，孔隙間間隔粗細不均(圖1A，見第637頁)。靜電紡絲法制備的PLGA支架表面由直徑較均一的亞微米或納米級PLGA纖維構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙形狀不規(guī)則，空隙之間相互貫通，可以實現(xiàn)營養(yǎng)之間的交換(圖1B，見第637頁)。

在成肌細胞與支架材料復合培養(yǎng)72 h后，可以看到細胞在兩種支架周圍充分鋪展、增殖，生長良好。透過溶液澆鑄－粒子洗出法制備的PLGA支架孔洞可以看見材料周圍成肌細胞充分鋪展、分裂，生長良好(圖2A，見638頁)。電紡法制備的支架由于纖維的交錯，較粒子洗出法制備的支架明顯致密，孔洞較小且較規(guī)則，在材料周圍可以看見生長、增殖良好的成肌細胞(圖2B，見638頁)，可見PLGA－膠原支架材料具有良好的細胞生物相容性。

2.2 MTT檢測結(jié)果 MTT結(jié)果可見，離子洗出組、靜電紡絲組和對照組的成肌細胞隨著培養(yǎng)時間的延長而呈現(xiàn)明顯的增殖(圖3)。培養(yǎng)的第1天，各組的MTT值沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。在第2，3天，三組的細胞均明顯增殖，MTT檢測吸光度遠遠高于第1天，但三組間仍無顯著性差異。在第5天時，靜電紡絲組的細胞仍然呈現(xiàn)出良好的增殖活性，MTT值明顯增高，但是離子洗出組及對照組的細胞增殖活性明顯降低，電紡組與另兩組間出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，而第7天時，電紡組的細胞數(shù)量亦出現(xiàn)回落，但仍明顯高于空白組和粒子洗出組。

圖3 PLGA－膠原支架復合培養(yǎng)后大鼠成肌細胞的增殖情況Fig 3 The proliferation of rat myoblasts after cultured with the two PLGA-collagen scaffolds

3 討論

3.1 不同制作工藝對三維支架性能的影響 粒子洗出法主要是使用一定粒徑分布的水溶性離子如NaCl鹽粒、明膠微球等作為致孔劑，運用支架材料與致孔劑的不同溶解性，制得一定孔徑分布和孔隙率的三維多孔支架材料。這種方法主要是通過調(diào)節(jié)致孔劑的大小和多少來控制支架的孔隙大小和孔隙率，以及支架的厚度［2］。利用粒子洗出法所制備的支架材料孔隙較大而且孔孔相通性稍差。靜電紡絲法主要是利用高壓發(fā)生器將一定濃度的液體形成一股帶電的噴射流，并在電場中運動、拉伸，最終沉積在接收屏上，成為直徑很小的纖維狀物質(zhì)。這些纖維的直徑通常達到納米或亞微米的尺度范圍［10，11］。靜電紡絲所制備的支架材料具有特殊的三維多孔結(jié)構(gòu)，達到孔孔相通，對液體有極好的濾過性，能夠很大程度滿足細胞營養(yǎng)和代謝的需求，在幾何尺寸上與生物體內(nèi)的支持組織的微觀結(jié)構(gòu)存在一致性，所以電紡工藝提供了一種模仿天然細胞外基質(zhì)的手段。

3.2 不同方法制備PLGA－膠原復合支架對大鼠成肌細胞增殖的影響 本研究采用了MTT法檢測大鼠成肌細胞與不同方法制備的PLGA－膠原支架復合培養(yǎng)不同時間點細胞的增殖情況。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)是細胞生物學及組織工程學中檢測細胞增殖活性的常用手段之一，其基本原理是活細胞的線粒體脫氫酶可將MTT轉(zhuǎn)變?yōu)榧篆?formazan)，后者為不溶于水的紫色顆粒，其生成量與細胞數(shù)目和細胞活性呈正相關，所生成的甲瓚溶解于二甲基亞砜(DMSO)后，檢測光密度值變化，即可間接反映出細胞的增殖活性。本次實驗結(jié)果可見，與空白對照組相比，與PLGA－膠原支架復合培養(yǎng)的大鼠成肌細胞在培養(yǎng)前3 d數(shù)量并沒有顯著減少;培養(yǎng)5－7 d后，相比于空白對照組和粒子洗出組，電紡組PLGA－膠原復合支架上培養(yǎng)的細胞數(shù)量顯著增高。這主要是因為電紡支架材料具有孔孔相通的微觀結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)液與細胞之間可以進行充分的養(yǎng)分交換。由此可知，應用上述兩種方法制備的PLGA－膠原復合支架材料均具有良好的生物相容性，對大鼠成肌細胞的增殖均未產(chǎn)生不良影響。而電紡法制備的PLGA－膠原支架材料表現(xiàn)出比粒子洗出法制備的材料更加優(yōu)越的生物及理化性能，可在一定程度上促進大鼠成肌細胞的增殖、分化。

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