布地奈德對(duì)變應(yīng)性鼻炎嗅覺障礙干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

王曉巍，朱瑩瑩，倪道鳳

嗅覺作為人體的重要感覺之一，在人類的社會(huì)生活中發(fā)揮著重要的作用。嗅覺的主要功能包括辨別氣味、識(shí)別環(huán)境、引起食欲及情緒調(diào)節(jié)等。人的嗅覺敏感與否對(duì)生活、學(xué)習(xí)和工作影響很大。嗅覺障礙在人群中并不少見，有研究曾對(duì)150萬(wàn)人進(jìn)行嗅覺調(diào)查，其中1.2%有永久性嗅覺喪失，62.4%有暫時(shí)性嗅覺喪失［1］。

多種因素可引起臨床嗅覺障礙。變應(yīng)性鼻炎 (allergic rhinitis，AR)是常見的耳鼻咽喉科疾病，也是臨床上引起嗅覺障礙的主要原因之一。目前各項(xiàng)流行病學(xué)研究趨向認(rèn)為，在人群中，AR的發(fā)病率為10% ～30%［2］。嗅覺障礙是AR的常見伴隨癥狀，有較多相關(guān)報(bào)道提到嗅覺喪失或減退與鼻部變態(tài)反應(yīng)相關(guān)［3］。Cowart等［4］調(diào)查顯示23.1%的AR患者存在嗅覺減退。Rombaux等［5］報(bào)道AR引起嗅覺減退的發(fā)病率為15% ～20%。AR引起嗅覺障礙的機(jī)制尚未完全明了。既往的觀點(diǎn)認(rèn)為由于鼻腔的炎癥導(dǎo)致氣味分子到達(dá)鼻腔頂部嗅覺感受器的通道受阻是導(dǎo)致嗅覺障礙的主要原因，即傳導(dǎo)性嗅覺障礙。而近來(lái)的研究表明，嗅上皮因變態(tài)反應(yīng)引起嗅上皮組織病理學(xué)變化，即感覺性嗅覺障礙，可能是AR患者產(chǎn)生嗅覺障礙的直接原因之一［6］。

無(wú)論是AR，還是其他原因?qū)е碌男嵊X障礙，目前尚無(wú)理想的治療藥物。臨床上常應(yīng)用糖皮質(zhì)激素 (glucocorticoid，GC)來(lái)治療嗅覺障礙。Faulcon等［7］用GC治療41例病毒感染后嗅覺障礙的患者，發(fā)現(xiàn)治療后效果良好。Heilmann等［8］對(duì)55例患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，口服潑尼松龍可以改善上呼吸道感染、鼻竇炎、特發(fā)性嗅覺障礙等各種原因引起的嗅覺障礙。Stevens［9］指出對(duì)鼻息肉鼻內(nèi)鏡術(shù)后已解除阻塞但仍有嗅覺障礙的患者，每天口服40 mg潑尼松 (逐漸減量)有助于嗅覺的改善。北京協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科在臨床應(yīng)用局部氣動(dòng)噴射霧化吸入GC治療嗅覺障礙也取得了較好的療效［10－11］。目前尚缺乏應(yīng)用GC專門針對(duì)AR引發(fā)的嗅覺障礙進(jìn)行治療的臨床研究，但GC作為AR的一線選擇用藥，已經(jīng)在臨床工作中得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)研究是采用卵清蛋白致敏小鼠，建立AR的小鼠模型，觀察小鼠鼻腔嗅上皮的組織病理學(xué)變化。進(jìn)而通過(guò)鼻內(nèi)滴用布地奈德，對(duì)小鼠嗅黏膜的嗅覺標(biāo)記蛋白 (olfactory marker protein，OMP)的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，探討GC治療AR嗅覺障礙的作用。

1 資料與方法

1.1 造模

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)BALB/C小鼠70只，雄性，8周齡，體質(zhì)量 (25±1)g。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表以簡(jiǎn)單隨機(jī)化分組法將全部動(dòng)物分為模型組 (60只)及對(duì)照組 (10只)。

1.1.2 致敏階段 模型組小鼠腹腔注射卵清蛋白Al(OH)3溶液，濃度40μg/ml。配制方法以20 mg卵清蛋白加2 mg Al(OH)3佐劑，0.9%氯化鈉溶液定容500 ml，溶液于臨用前配制。腹腔注射200μl(約300μg/kg)，隔天1次，連續(xù)7次。對(duì)照組以等量0.9%氯化鈉溶液代替卵清蛋白溶液。

1.1.3 激發(fā)階段 模型組小鼠鼻腔滴入卵清蛋白溶液，濃度為50μg/ml。于致敏階段結(jié)束間隔7 d后，以戊巴比妥腹腔內(nèi)注射麻醉，以移液器吸取卵清蛋白溶液40μl(約80μg/kg)，緩慢均勻滴入小鼠雙側(cè)前鼻孔，隨呼吸進(jìn)入鼻腔。每天激發(fā)1次，連續(xù)激發(fā)7 d。對(duì)照組以等量0.9%氯化鈉溶液代替卵清蛋白溶液。

1.1.4 造模評(píng)估 采用癥狀行為學(xué)疊加量化計(jì)分法對(duì)模型組進(jìn)行評(píng)估［12］。于末次鼻腔激發(fā)致敏后立即觀察30 min，記錄小鼠鼻分泌量、噴嚏次數(shù)及搔鼻情況，采用疊加量化計(jì)分法，總積分＞5分者為造模成功 (見表1)。

表1 癥狀記分標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 Symptom scoring standard

1.2 嗅覺功能評(píng)估 嗅覺障礙檢查采用埋藏小球?qū)嶒?yàn) (buried food test，BFT):將食物小球埋藏在墊料中，位置隨機(jī)選擇，深度為1～2 cm。將模型組小鼠放入實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所中，以300 s(5次測(cè)試的平均值)內(nèi)未找到食物小球的小鼠即定為存在嗅覺功能障礙，列入AR伴嗅覺障礙組 (42只)，其余小鼠列入AR不伴嗅覺障礙組 (13只)。同時(shí)對(duì)對(duì)照組小鼠進(jìn)行BFT測(cè)試，并與模型組結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。

1.3 組織取材 于建模成功后第3天，選取全部對(duì)照組小鼠及AR不伴嗅覺障礙組小鼠、AR伴嗅覺障礙組小鼠各9只。斷髓處死動(dòng)物，去除頭部的毛皮，暴露頭顱標(biāo)本。進(jìn)一步修剪頭顱標(biāo)本，保留鼻腔上部，包括鼻中隔、鼻腔外側(cè)壁及篩板。將標(biāo)本浸于4%多聚甲醛溶液中約48 h，取出后浸入10%EDTA溶液中脫鈣14 d，每日更換脫鈣液。14 d后，標(biāo)本以自來(lái)水沖洗24 h，之后重新浸入4%多聚甲醛溶液中固定約24 h。1.4 藥物干預(yù) 將剩余的AR伴嗅覺障礙組小鼠簡(jiǎn)單隨機(jī)化分為不用藥組10只、布地奈德干預(yù)1組及布地奈德干預(yù)2組各11只。布地奈德干預(yù)1、2組小鼠雙側(cè)鼻腔內(nèi)各滴入30μl布地奈德 (雷諾考特，鼻內(nèi)噴霧用細(xì)微顆?；鞈乙?，規(guī)格為7.68 mg，6 ml，阿斯麗康公司)藥物原液，1次/d，連續(xù)5 d。不用藥組不給予藥物干預(yù)。于開始給藥后第7天處死布地奈德干預(yù)1組及不用藥組動(dòng)物并取材，于開始給藥后第14天處死布地奈德干預(yù)2組動(dòng)物，同法取材。

1.5 HE染色 在對(duì)照組、AR不伴嗅覺障礙組、AR伴嗅覺障礙組中，每組隨機(jī)選取3個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取切片做HE染色。

1.6 免疫組化 各組中每組簡(jiǎn)單隨機(jī)化選取3個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取切片。光鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本各5張切片，在統(tǒng)一放大倍數(shù) (×400)下，隨機(jī)檢測(cè)并計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野 (×400)下的全部OMP陽(yáng)性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，所得到的數(shù)值以表示，各組數(shù)據(jù)的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般指標(biāo)觀察 在鼻內(nèi)滴液激發(fā)階段過(guò)后，模型組小鼠死亡5只，對(duì)照組小鼠死亡2只。存活的兩組小鼠均毛色光澤，攝食飲水正常，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)正常、活躍。

2.2 造模評(píng)估 采用癥狀行為學(xué)疊加量化計(jì)分法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。經(jīng)觀察對(duì)比，模型組小鼠在致敏前計(jì)分均值為 (0.51±0.49)，經(jīng)致敏激發(fā)后模型組小鼠頻頻用前爪抓搔鼻端兩側(cè)，并伴有發(fā)作性的噴嚏動(dòng)作，鼻分泌物流出量從鼻端兩道濕痕至鼻口周圍大量清亮液體不等 (見表2)。模型組小鼠在致敏激發(fā)后計(jì)分均值為 (6.17±1.67)分，計(jì)分明顯增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=3.964，p＜0.01)。對(duì)照組小鼠給藥前計(jì)分均值 (0.47±0.38)分，給藥后未出現(xiàn)明顯癥狀，計(jì)分均值為 (0.63±0.47)分，計(jì)分增高無(wú)明顯變化，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=1.593，P＞0.05)。因而可以認(rèn)定本實(shí)驗(yàn)采用卵清蛋白致敏激發(fā)小鼠建立AR小鼠模型的方法是成功的。

2.3 嗅覺功能評(píng)估 應(yīng)用BFT，分別對(duì)模型組及對(duì)照組小鼠進(jìn)行嗅覺功能評(píng)估。其中對(duì)照組8只小鼠均可于300 s內(nèi)找到埋藏的食物小球，平均時(shí)間 (122±4)s。而模型組小鼠中有13只于300 s內(nèi)找到食物小球，平均時(shí)間 (159±3)s。其余42只均無(wú)法在300 s內(nèi)尋找到埋藏的食物小球。伴有嗅覺障礙的模型小鼠占全部模型組小鼠數(shù)量的76.36%。

2.4 HE染色 對(duì)照組:嗅區(qū)黏膜由上皮層和固有層構(gòu)成(見圖1)。嗅上皮可見 ORNs、支持細(xì)胞 (supporting cells，SCs)和基底細(xì)胞 (basal cells，BCs)。嗅感受神經(jīng)元 (olfactory receptor neurons，ORNs)的細(xì)胞核為類圓形，深藍(lán)色，位于嗅上皮的中部，呈多層排列，7～8層;SCs的細(xì)胞核為橢圓形，淡藍(lán)色，位于嗅上皮近表層;BCs的細(xì)胞核較小，扁圓形，位于嗅上皮的底層，靠近基底膜;固有層中可見嗅神經(jīng)和血管 (見圖2)。嗅黏膜上皮層中各層細(xì)胞排列整齊，極性明顯 (見圖3A)。模型組嗅黏膜上皮層變薄，ORNs層數(shù)減少，排列紊亂，與對(duì)照組有明顯區(qū)別 (見圖3B、3C)。

2.5 免疫組化 對(duì)照組:光鏡下OMP免疫陽(yáng)性細(xì)胞為棕褐色染色，分布于嗅黏膜的上皮層和固有層，在嗅黏膜表面的纖毛也可見OMP反應(yīng) (見圖4、5A)。模型組:鏡下見嗅黏膜上皮層變薄，染色變淡，OMP表達(dá)較對(duì)照組減少 (見圖5B、5C)。經(jīng)圖像分析儀對(duì)5個(gè)高倍視野 (×400)下的上皮層染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，AR不伴嗅覺障礙組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=1.237，P＞0.05);AR伴嗅覺障礙組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=6.921，p＜0.05)。經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)階段，進(jìn)一步對(duì)AR伴嗅覺障礙小鼠進(jìn)行觀察，其中不用藥組:嗅黏膜上皮層厚度有所增加，細(xì)胞排列仍較紊亂。上皮層OMP表達(dá)稍有增多 (見圖5D)。OMP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與AR伴嗅覺障礙組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=2.003，P＞0.05)。布地奈德干預(yù)1組:嗅黏膜上皮層厚度有所增加，上皮層OMP表達(dá)增多 (見圖5E)。OMP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與AR伴嗅覺障礙組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=3.360，p＜0.05)，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=1.676，P＞0.05)。布地奈德干預(yù)2組:與布地奈德干預(yù)1組表現(xiàn)相似 (見圖5F)，OMP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與布地奈德干預(yù)1組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.197，P ＞0.05，見表3)。

表2 模型組小鼠癥狀觀察情況 (只)Table 2 Symptom observation of rats in model group

表3 各組嗅上皮OMP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較Table 3 Comparsion of olfactory epithelium OMPpositive cells in each group

圖1 小鼠嗅黏膜HE染色 (×100)示:小鼠嗅黏膜由上皮層和固有層構(gòu)成。嗅黏膜上皮層 (?);嗅黏膜固有層 (☆)Figure 1 HE staining of rat olfactory mucosa:olfactory mucosa of rat is composed by epithelium and lamina propria.Epithelium propria(?)，lamina propria(☆)

圖2 小鼠嗅黏膜HE染色 (×200)示:嗅感受神經(jīng)元 (O);支持細(xì)胞 (S);基底細(xì)胞 (B);血管 (?);固有層嗅神經(jīng)纖維(☆)Figure 2 HE staining of rat olfactory mucosa:olfactory receptor neurons(O)，supporting cells(S)，basal cells(B)，blood vessel(?)，olfactory nerve fiber in lamina propria(☆)

圖3 各組小鼠嗅黏膜HE染色 (×400)Figure 3 HE staining of rat olfactory mucosa in each group

圖4 小鼠嗅黏膜免疫組化OMP表達(dá) (×200):OMP免疫陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色染色。嗅黏膜上皮層 (?);嗅黏膜固有層 (☆)Figure 4 Immunohistochemical expression of OMP in rat olfactory mucosa(×200):OMP immunoreactive cells are brownish yellow staining.Epithelium propria(?)，lamina propria(☆)

圖5 各組小鼠嗅黏膜免疫組化OMP表達(dá) (×400)Figure 5 Immunohistochemical expression of OMP in rat olfactory mucosa in each group

3 討論

AR是特應(yīng)性個(gè)體接觸致敏原后由IgE介導(dǎo)的遞質(zhì) (主要是組胺)釋放、并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾病。AR的主要臨床表現(xiàn)有鼻塞、流鼻涕、鼻癢、打噴嚏以及嗅覺功能障礙等。由于其在人群中發(fā)病率高，且發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)［13－14］，特別是其可損傷患者嗅覺引發(fā)嗅覺障礙［15－16］。因此AR是引起嗅覺障礙的主要因素之一。

建立動(dòng)物模型是研究AR發(fā)病機(jī)制及病理生理變化的基礎(chǔ)和手段。本實(shí)驗(yàn)選擇BALB/C小鼠作為建模動(dòng)物，利用卵清蛋白加佐劑氫氧化鋁先使動(dòng)物機(jī)體致敏，再滴鼻維持致敏狀態(tài)，方法簡(jiǎn)單，復(fù)制了在體征和病程方面都與人的臨床AR近似的動(dòng)物疾病模型，經(jīng)癥狀行為學(xué)測(cè)試符合建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)的改變?cè)u(píng)估其嗅覺功能是目前廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法。BFT是Edwards早在1972年就在研究小鼠嗅覺障礙的行為時(shí)即已應(yīng)用了的嗅覺評(píng)估方法。此后該類方法不斷改進(jìn)［12－18］。進(jìn)行BFT操作所需實(shí)驗(yàn)裝置花費(fèi)低，操作比較容易，具有良好的可行性及可重復(fù)性。判斷嗅覺障礙的標(biāo)準(zhǔn)即找到食物小球的時(shí)間大于300 s為存在嗅覺障礙。在本實(shí)驗(yàn)分組前對(duì)所有小鼠進(jìn)行BFT預(yù)評(píng)估，所有小鼠均在300 s內(nèi)找到食物小球。嗅覺行為學(xué)試驗(yàn)以300 s為分組標(biāo)準(zhǔn)是合理可行的。通過(guò)BFT檢測(cè)，約76.36%的AR小鼠表現(xiàn)出嗅覺功能的障礙，可見嗅覺障礙是AR常見的癥狀。本實(shí)驗(yàn)中，AR模型動(dòng)物的嗅黏膜上皮層變薄，各層細(xì)胞排列不整齊，層數(shù)明顯減少，極性消失，說(shuō)明AR模型小鼠的嗅黏膜發(fā)生了明顯的病理改變，其嗅感受神經(jīng)元本身存在病理?yè)p傷。

在嗅覺相關(guān)的研究中，OMP是近年來(lái)頗受關(guān)注的熱點(diǎn)。OMP是與嗅覺密切相關(guān)的一種蛋白質(zhì)，特異性地表達(dá)于成熟的ORNs。ORNs是嗅黏膜內(nèi)惟一的神經(jīng)元，其功能是感受空氣中的氣味分子，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，向嗅球和嗅覺高級(jí)中樞傳遞嗅覺信息［19－21］。研究嗅上皮中OMP的表達(dá)，可以顯示出ORNs在嗅上皮內(nèi)的分布情況，并能說(shuō)明致病因素對(duì)嗅上皮中ORNs的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化方法，對(duì)嗅上皮中的OMP表達(dá)進(jìn)行定位、定性及定量的分析。結(jié)果顯示，AR小鼠嗅黏膜的OMP表達(dá)比對(duì)照組減低，其中伴有嗅覺障礙的AR小鼠嗅黏膜的OMP表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。進(jìn)一步說(shuō)明了AR伴有嗅覺障礙的小鼠嗅黏膜本身發(fā)生了病理改變。

GC是臨床治療嗅覺障礙的常用藥物［22］。GC治療嗅覺障礙的作用機(jī)制尚不完全清楚。目前已知GC通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)抗炎因子的合成，減輕嗅黏膜的炎癥反應(yīng)，減輕其充血和腫脹，以增加空氣中的氣味分子與嗅區(qū)黏膜的接觸面積，促進(jìn)氣味分子與ORNs結(jié)合，改善嗅覺。除上述的改善傳導(dǎo)性因素的作用外，糖皮質(zhì)激素對(duì)嗅黏膜本身也發(fā)揮著直接的作用。研究發(fā)現(xiàn)嗅黏膜中存在糖皮質(zhì)激素受體［23］，存在接受糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的Na+－K+－ATP酶［24］。這些分子水平上的發(fā)現(xiàn)，均為GC通過(guò)直接影響嗅黏膜治療嗅覺障礙提供了一定的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用布地奈德鼻內(nèi)滴用進(jìn)行干預(yù)7 d后，觀察到小鼠嗅黏膜OMP的表達(dá)顯著高于用藥前水平，也高于同期觀察的不用藥的小鼠，而與對(duì)照組的OMP表達(dá)水平相當(dāng)，說(shuō)明鼻內(nèi)局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可以增加嗅上皮中嗅感受神經(jīng)元的數(shù)量。而用藥后第14天觀察到的嗅黏膜OMP表達(dá)與用藥后7 d的結(jié)果相當(dāng)，均與對(duì)照組OMP的表達(dá)無(wú)明顯差異，說(shuō)明鼻內(nèi)局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素增加嗅上皮ORNs的數(shù)量、改善嗅覺功能的作用，可以持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。在臨床工作中，對(duì)于全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，其對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的副作用是醫(yī)患雙方均力圖規(guī)避的問(wèn)題。而鼻內(nèi)局部應(yīng)用的糖皮質(zhì)激素藥物具有局部吸收，全身生物利用度低，副作用小的明顯優(yōu)點(diǎn)。因此，鼻內(nèi)局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素是治療AR引起的嗅覺障礙的較好方法。

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