HPLC法同時(shí)測(cè)定火絨草中木犀草苷和咖啡酸的含量

楊 梓 樊 暉 張 慧 張宇瑤 翟延君*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032

火絨草 Leontopodium Leontop odioides(wild.)Beauv.別名:老頭草、薄雪草、老艾頭。系菊科火絨草屬植物火絨草的干燥全草。夏、秋季采割，以地上全草入藥。多生于草原、山坡、地埂等處，廣泛分布于我國(guó)東北、西北、華北和西南等地。野生資源極其豐富，是我國(guó)北方民間常用中草藥之一［1］。性寒，味微苦，入腎、膀胱二經(jīng)。具有清熱涼血、消炎利尿等功效。其對(duì)流行感冒，急、慢性腎炎，尿路感染，尿血，創(chuàng)傷出血等癥狀有一定的治療作用。蒙醫(yī)用于肺熱咳嗽，咳痰不爽，肺膿瘍，喘咳，痰中帶血，感冒咳嗽的治療;藏醫(yī)用于治療流行性感冒，瘟病時(shí)疫，礦物藥中毒，砒霜中毒，肉瘤，瘡癤疔毒，出血亦可作艾炙用［2］。

李禮［3］等人在火絨草的化學(xué)成分研究中從火絨草的乙醇提取物中分離得到木犀草苷、小檗堿、阿魏酸、咖啡酸和香草酸等14種化合物。其有效成分之一咖啡酸具有止痛、抗炎癥、抗肝毒、抗?jié)兊茸饔?，與火絨草用于尿路感染有關(guān)［4］。雖然火絨草的部分活性成分已明確，但其含量測(cè)定方法尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定火絨草中木犀草苷和咖啡酸含量的方法，為其品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司)，G1379A真空脫氣機(jī)，G1311A四元梯度泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315A柱恒溫箱，G1315B二極管陣列檢測(cè)器，Agilent B 04.03化學(xué)工作站;AE－240電子分析天平;SHB－ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);HN101－3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 (南通滬南科學(xué)儀器有限公司);DK－98－1型電熱恒溫水浴箱 (天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥 火絨草藥材 (購(gòu)自河北安國(guó)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為菊科火絨草屬火絨草);木犀草苷對(duì)照品:由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為111720－200603，咖啡酸對(duì)照品:由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為110885－200102，甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:采用Agilent TC－C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈為流動(dòng)相A，0.5%冰醋酸為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫 (表1);柱溫:25℃;檢測(cè)器:DAD;檢測(cè)波長(zhǎng):咖啡酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm，木犀草苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm;流速:1 mL/min;

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含29.6μg的溶液，即得。取咖啡酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含760μg的溶液，即得。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間表

2.3 供試品溶液的制備 取本品約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，稱定重量，超聲處理 (功率250w頻率35kHz)1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10mL，回收溶劑至干，殘?jiān)?0%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察 取木犀草苷對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣5、10、15、20、25μL，記錄色譜峰面積。取咖啡酸對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μL，記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量 (ug)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)線性回歸，木犀草苷的回歸方程為Y=2070.541X+219.04，r=0.9996;咖啡酸的回歸方程為Y=5230.132X+112.57，r=0.9997。結(jié)果表明木犀草苷在0.148μg～0.74μg，咖啡酸在0.076μg～0.38μg范圍內(nèi)各峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一供試品溶液于室溫條件放置，于0、2、4、6、8h分別精密吸取5μL進(jìn)樣，測(cè)定，記錄峰面積值，結(jié)果木犀草苷峰面積在8小時(shí)內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，RSD為1.03%;咖啡酸峰面積在8小時(shí)內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，RSD為1.67%。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，進(jìn)樣5μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，木犀草苷峰面積RSD為0.52%;咖啡酸峰面積RSD為1.88%。結(jié)果表明，精密度良好，符合定量分析要求。2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批供試品，按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法，重復(fù)制備樣品6次，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算木犀草苷的平均含量RSD為1.38%;咖啡酸的平均含量RSD為1.91%。結(jié)果表明，供試品制備方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的木犀草苷和咖啡酸的樣品約0.4g，共6份，分別精密加入木犀草苷和咖啡酸對(duì)照品各0.1mg，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，木犀草苷加樣回收率為96.2%，RSD為1.13%;咖啡酸加樣回收率為98.4%，RSD為2.29%。符合定量分析要求。

2.9 樣品含量測(cè)定 取3批中試樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定火絨草中木犀草苷和咖啡酸的含量，由于提取物是由火絨草單味藥經(jīng)75%乙醇提取而成，不需要過(guò)多的處理方法，即可將指標(biāo)成分較好的分離。故本實(shí)驗(yàn)采取溶劑提取法制備含測(cè)樣品。之后又比較了70%的乙醇回流提取和超聲提取法的提取效率，差別不大，而且超聲提取方法簡(jiǎn)便，故本方法最終采用70%的乙醇超聲提取，制備供試品溶液。本實(shí)驗(yàn)采用乙腈－0.5%冰醋酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，咖啡酸在12min左右出峰，木犀草苷在21min左右出峰，獲得良好的分離度和峰形，并分別對(duì)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率進(jìn)行了考察，結(jié)果表明本文介紹的測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)單、回收率合格，為火絨草藥材的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］《全國(guó)中草藥匯編》編寫組.全國(guó)中草藥匯編 (上冊(cè)，第2版)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:14.

［2］劉軒，邸子真，初正云，等.火絨草的生藥學(xué)鑒定研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11(8):217－218.

［3］李禮.火絨草的化學(xué)成分研究［D］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，2008.

［4］董玉，馬強(qiáng)，那生桑，等.高效液相色譜法測(cè)定蒙藥冬葵果中咖啡酸的含量［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(2):117－119.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典 (一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.