EML4-ALK融合基因在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展

華紅偉綜述 丁 罡審校

棘皮動物微管結(jié)合樣蛋白4(echinoderm microtubule associated protein-like 4，EML4)與間變淋巴瘤激酶(anaplastie lymphoma kinase，ALK)融合基因EML4-ALK是非小細(xì)胞肺癌中繼EGFR突變，K-ras突變后又一特異性分子標(biāo)記物，近些年來引起了高度重視，有望成為NSCLC新的靶點。本文就EML4-ALK融合基因的發(fā)現(xiàn)和檢測，生物學(xué)特性，EML4-ALK抑制劑的應(yīng)用等綜述如下。

1 EML4-ALK的發(fā)現(xiàn)及生物學(xué)特征

1.1 EML4-ALK的發(fā)現(xiàn)及亞型

EML4-ALK是NSCLC中最新發(fā)現(xiàn)的1種癌基因。EML4是棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣蛋白質(zhì)家族成員［1］，它包括一個N-端基本區(qū)，一個疏水的棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣蛋白域和WD重復(fù)區(qū)。ALK首先在間變性大細(xì)胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)，作為一個核磷蛋白的融合者，伴隨一個t(2;5)染色體重排［2］。EML4-ALK融合基因最初是在2007年由Soda等［3］首先發(fā)現(xiàn)的，他們從1例62歲吸煙的肺腺癌患者的腫瘤組織中擴(kuò)增出由3，926 bp組成的DNA片段，該片段可以編碼一個由1 059個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的N末端是由人類EML4基因編碼蛋白的一部分，而羧基端是人類ALK基因編碼的胞內(nèi)絡(luò)氨酸激酶信號受體。EML4一ALK融合基因由第2號染色體短臂插入引起(包括2p21和2p23)，由ALK基因的3'端與EML4基因的5'倒位融合形成。以EML4的這部分區(qū)域代替ALK的包外區(qū)和跨膜控制區(qū)將導(dǎo)致ALK激活酶控制區(qū)特定的二聚化作用，以及由此產(chǎn)生的持續(xù)的接觸反應(yīng)活動，從而導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致癌變。在隨后的研究中，他們應(yīng)用RT-PCR的方法在75例肺癌患者中提取腫瘤癌組織檢測該融合基因，發(fā)現(xiàn)共有5例(6.7%)患者(3例腺癌，2例鱗癌)EML4-ALK融合基因表現(xiàn)為陽性，同時發(fā)現(xiàn)該基因陽性的患者與EGFR和K-ras突變陽性的患者沒有重疊，并且檢測了261例其他惡性腫瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、結(jié)直腸癌、胃腸道腫瘤)均未發(fā)現(xiàn)該融合基因。因此，該融合基因很有可能是非小細(xì)胞肺癌的一個新的特異性基因靶點。

研究發(fā)現(xiàn)，該染色體倒置并不總是發(fā)生在相同的部位，目前已發(fā)現(xiàn)多個EML4-ALK變異亞群。包括亞型3(E6;A20)［4］、亞型 4(E15;A20)，亞型 5(E2;A20)［5］，亞型 6(E18;A20)，亞型7(E14;A20)［6］等，其中，最常見的變異位點為 E13;A20(存在于NSCLC細(xì)胞株H3122和DFCI032中)及E6a/b;A20(存在于NSCLC細(xì)胞株H2228)，分別被成為變異1和變異3a/b，在非小細(xì)胞肺癌中分別占33%和29%［7］。所有的亞型都含有ALK胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，始于編碼外顯子20的位置。這些亞群是否具有不同的臨床意義還有待進(jìn)一步研究。

1.2 EML4-ALK融合基因在NSCLC中的發(fā)生率及臨床生物學(xué)特征

研究表明，EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中陽性比例較低。Solomon等［8］發(fā)現(xiàn)不加選擇的NSCLC患者EML4-ALK融合基因總發(fā)生率為0.4% ～13.5%，這部分患者多為非吸煙者，且大多數(shù)是肺腺癌。2009年Wong等［9］對266例手術(shù)切除的原發(fā)性肺癌患者的標(biāo)本進(jìn)行了檢測，在13例NSCLC患者(4.9%)標(biāo)本中檢出了融合基因，并發(fā)現(xiàn)融合基因更易發(fā)生于不吸煙、年輕以及EGFR，K-ras野生型的肺癌患者。Shaw等［10］為提高融合基因的陽性率，他們以女性、亞裔、輕度或者不吸煙的腺癌中至少符合2項為標(biāo)準(zhǔn)，挑選了141例NSCLC，使用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH技術(shù))檢測 EML4-ALK、EGFR以及K-ras突變情況。結(jié)果表明，13%(19例)患者為EML4-ALK陽性，上述3種突變沒有重疊。與EGFR突變(31例)和EGFR、ALK突變均陰性的野生型(91例)相比，EML4-ALK陽性的患者更年輕(P ＜0.001)，多為男性(P=0.036)，輕度或者不吸煙(P＜0.001)，這些臨床特征有助于EML4-ALK的識別和肺癌的早期診斷。為了更好地了解中國人群中該融合基因的表達(dá)情況，Zhang等［11］在103例非小細(xì)胞肺癌中將RACE偶聯(lián)PCR測序技術(shù)(RACE-coupled PCR sequencing)檢測ALK融合基因的頻率，發(fā)現(xiàn)中國的非選擇性NSCLC患者中該融合基因的發(fā)生率為11.6%，但肺腺癌患者可升至19.2%，從不吸煙者為19.2%，EGFR和K-ras均為野生型的肺腺癌患者則高達(dá)42.8%。該研究表明，EML4-ALK融合基因與以下3個因素有關(guān):無吸煙史(P=0.03)，年紀(jì)較輕初發(fā)者(P=0.03)，無 EGFR/KRAS突變的肺腺癌(P=0.04)。并且，EML4-ALK融合基因陽性的肺癌中ALK的mRNA水平要高于該融合基因陰性的患者，但是EML4的表達(dá)在EML4-ALK融合基因陰性組與陽性組中無差別，因此EML4-ALK融合基因可能與ALK的的表達(dá)水平有著密切的關(guān)系。2010年，Sun等［12］對東亞地區(qū)非吸煙肺腺癌中的突變基因進(jìn)行研究。分析從單一群體中(復(fù)旦大學(xué)附屬上海腫瘤醫(yī)院，中國上海)切除的52例無吸煙史的肺腺癌并發(fā)的基因突變:KRAS，NRAS，HRAS，HER2，BRAF，ALK，PIK3CA，TP53和LKB1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)41例腫瘤存在EGFR突變，3例存在EML4-ALK融合基因，2例存在FER2插入，1例存在KRAS突變。BRAF，NRAS，HRAS，LKB1突變未被發(fā)現(xiàn)。此項研究是首個對一大群東亞地區(qū)無吸煙史的肺腺癌患者全面且同步地分析主要致瘤突變的研究，進(jìn)行突變預(yù)測試驗對于個體化的靶向治療有重要的指導(dǎo)意義。

既往的研究［3，11］認(rèn)為 EGFR突變與 EML4-ALK突變不共存，EML4-ALK融合型基因可能是繼KRAS之后的EGFR對TKI耐藥的另外一個原因。隨著研究的深入，臨床發(fā)現(xiàn)了EGFR突變與EML4-ALK突變同時存在的病例，如Tiseo等［13］報道了1例同時具有EGFR突變和EML4-ALK突變的病例，該患者是1例48歲無吸煙史的高加索男性患者，使用EGFR-TKIs(厄洛替尼)治療未有臨床益處。而Kuo等［14］報道了1例72歲的非吸煙女性肺腺癌患者，該患者同時具有EGFR突變和EML4-ALK突變但使用EGFR-TKIs(吉非替尼)卻有臨床效果。因此，當(dāng)患者存在EML4-ALK融合基因時，還應(yīng)仔細(xì)檢測是否存在EGFR突變，對同時存在EGFR突變和EML4-ALK突變的肺癌的臨床生物學(xué)特征和最佳治療方案還有待進(jìn)一步研究。

2 EML4-ALK的檢測方法

在臨床實踐中已使用多種技術(shù)來檢測EML4-ALK融合基因，包括PCR技術(shù)(polymerase chain reaction)，免疫組化技術(shù)(immunohistochemistry，IHC)，熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridsation，F(xiàn)ISH)等。但是，目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)方法來檢測非小細(xì)胞肺癌中的EML4-ALK融合基因。

2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)

RT-PCR可能是檢測NSCLC中ALK融合基因的有效手段，該技術(shù)靈敏度較高，檢測到基因擴(kuò)增產(chǎn)物則暗示著ALK的重排。但是，RT-PCR分析基于單管多重技術(shù)(muitiplex)，不能檢測EML4-ALK融合基因的未知亞型，其對引物的要求較高，并且檢測甲醛固定的石蠟包埋切片，RNA易大量降解而降低其靈敏性。另外，有證據(jù)表明RT-PCR檢測EML4-ALK可能會擴(kuò)大假陽性［15］，即腫瘤組織和非腫瘤組織中都會出現(xiàn)ALK的重排。盡管RT-PCR有以上缺點，但仍然提倡使用RT-PCR的方法檢測EML4-ALK的融合基因。

2.2 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)

FISH是檢測ALK融合基因更加特異的方法，該分析方法在ALK基因斷裂點的對側(cè)使用2種不同的被標(biāo)記探針，正常的ALK出現(xiàn)黃色標(biāo)記，融合的ALK則表現(xiàn)紅色和綠色［16］。由于在應(yīng)用FISH技術(shù)時，要用到甲醛固定，石蠟包埋等，這些技術(shù)會對組織形態(tài)造成破壞，因此盡管FISH是1種檢測肺腺癌中ALK重排的靈敏而獨特的手段，卻并不完全可靠。最新的一項研究表明［17］，1例ALK重排的肺腺癌利用免疫組化技術(shù)來檢測檢測ALK蛋白表達(dá)時，在使用FISH分析時誤診為ALK野生型。并且，F(xiàn)ISH不能檢測不同種類的EML4-ALK融合。FISH現(xiàn)在用于PF-02341066(Crizotinib)的臨床試驗中，以≥15%的分離細(xì)胞核作為診斷ALK融合基因的標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry，IHC)

IHC技術(shù)分析FFPE組織是當(dāng)前外科病理實踐的主要方法，該方法的優(yōu)點是可以在不損失用于鑒別正常與病理組織的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點的情況下檢測腫瘤特異性抗原的表達(dá)。幾種人類ALK蛋白的特異性抗體已經(jīng)形成，并且有些經(jīng)過IHC試驗，已廣泛地應(yīng)用于診斷 ALK融合的漸變性大細(xì)胞瘤(ALCL)［18］。

Mino-Kenudson等［19］報道了1項關(guān)于IHC的實驗，該實驗使用提高FFPE中ALK蛋白表達(dá)靈敏性和特異性的抗體來分析174例腫瘤。通過試驗發(fā)現(xiàn)在22例ALK融合的肺腺癌患者中都表達(dá)了ALK蛋白，而在131例ALK為野生型的肺腺癌患者中未發(fā)現(xiàn)該蛋白。ALK融合的肺腺癌中ALK蛋白的表達(dá)水平比ALK融合的ALCL低，并且22例中的13例(59%)只有使用新式高靈敏度的IHC試驗才可以被檢測出。這些發(fā)現(xiàn)表明在ALK融合的肺癌中ALK的表達(dá)是受到限制的。這為在臨床病理醫(yī)生使用IHC試驗診斷適合ALK靶向治療的患者提供了可能性。但是存在ALK融合的組織中，即使使用最高靈敏度的IHC實驗，在活組織切片中其染色也可能不明顯，在這種情況下應(yīng)該考慮FISH技術(shù)作進(jìn)一步確認(rèn)。

盡管在全球臨床實驗室中用IHC技術(shù)診斷ALK融合的ALCL，但是該技術(shù)并不能發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ALK融合的肺腺癌，這是由于與ALK融合的ALAL相比，在ALK融合的非小細(xì)胞肺癌中ALK表達(dá)水平較低。為了克服這種限制，Takeuchi等［6］建立了1種插入式抗體強(qiáng)化聚合物(intercalated antibody-enhanced polymer，iAEP)方法，在ALK抗體和葡聚糖聚合物檢測試劑之間合并一個插入抗體。結(jié)果表明在免疫組化介導(dǎo)的EML4-ALK檢測中，使用 iAEP，在所有的 NSCLC樣本中均發(fā)現(xiàn)了已知的EML4-ALK陽性腫瘤。并且還發(fā)現(xiàn)了新的EML4-ALK亞型(亞型6(E18;A20)，亞型7(E14;A20))和一個新的ALK融合基因KIF5B-ALK。

目前還沒有公認(rèn)的檢測EML4-ALK融合基因的金標(biāo)準(zhǔn)，上述的技術(shù)都各有優(yōu)缺點，如何有效利用各種檢測分析技術(shù)簡單有效地檢測出該如何基因還有待進(jìn)一步研究。

3 ALK抑制劑的使用

先前的研究發(fā)現(xiàn)在EML4-ALK融合基因陽性的肺癌中ALK的mRNA水平要高于該融合基因陰性的患者，因此抑制ALK激酶可能是臨床1種有效的治療方法［3］。臨床前研究表明，應(yīng)用ALK抑制劑治療EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC時，關(guān)鍵性的信號傳導(dǎo)通路下調(diào)并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡［20，21］。這與EGFR L858R突變NSCLC細(xì)胞株H3255使用EGFR抑制劑吉非替尼時觀察的結(jié)果相類似［22］。ALK抑制劑在體內(nèi)試驗中的療效也得到評估，在由EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC細(xì)胞株產(chǎn)生的異種移植物模型中應(yīng)用ALK抑制劑也可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或者腫瘤的衰退縮減［23，24］。

PF-02341066(crizotinib)是口服的小分子ALK抑制劑，CrizotinibⅠ期臨床試驗開始于2006年5月。當(dāng)發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因以及PF-02341066可以抑制ALK后，參與該臨床實驗的包括MET突變或者ALK14突變的患者。Kwak等［25］從1 500例NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)82例(5.5%)攜帶1個ALK重排，在這些患者中使用1種新型的ALK激酶抑制劑:crizotinib(PF-02341066)進(jìn)行臨床試驗。在平均治療時間為6.4個月中，該藥物有效率達(dá)57%(47/82)，46例部分緩解和1例完全緩解，27例病情穩(wěn)定，該藥的副作用主要是輕度的胃腸道反應(yīng)。該研究結(jié)果首次在2009年ASCL大會上報告。鑒于PF-02341066較高的有效率和較好的安全性，該藥被批準(zhǔn)直接進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗，即使用crizotinib單藥與標(biāo)準(zhǔn)的二線化療(培美曲賽或多西紫杉醇)治療EML4-ALK陽性NSCLC隨機(jī)三期試驗;同時，不符合進(jìn)入Ⅲ期臨床研究的EML4一ALK陽性NSCLC患者接受PF-0234561066單藥治療的Ⅱ期臨床研究。2011年ASCO對Crizotinib的I期臨床試驗結(jié)果進(jìn)行了更新［26］，119例NSCLC患者使用PF-02341066治療時，中位無進(jìn)展生存期達(dá)到10個月(95%CI:8.2 ～14.7)，客觀有效率為 61%(95%CI:52% ～70%)，中位有效應(yīng)答時間為48 w，中位生存時間達(dá)1年的概率為81%。但是，Tanizaki等［27］發(fā)現(xiàn)盡管大多數(shù)EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC能從ALK抑制劑獲益，但是該藥物的療效在不同個體中有很大差別。在融合基因陽性的H3122細(xì)胞株中，ALK抑制劑TAE684通過抑制STAT3和ERK的磷酸化作用來抑制細(xì)胞的增殖，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在融合基因陽性的H2228細(xì)胞株中，TAE684只能抑制STAT3磷酸化，而不能抑制ERK磷酸化，對于細(xì)胞的增殖或者凋亡基本沒有影響，而MEK抑制劑可以聯(lián)合抑制STAT3和ERK通路從而誘導(dǎo)凋亡，因此，聯(lián)合使用TAE684和MEK抑制劑，對于STST3和ERK通路可以起到雙重抑制作用，從而下調(diào)抗凋亡蛋白存活素，上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)。

4 ALK抑制劑的耐藥問題

隨著藥物的應(yīng)用和研究的深入，ALK抑制劑將不可避免地出現(xiàn)耐藥性。Choi等［28］報道了1例EML4-ALK陽性的28歲非吸煙的男性NSCLC患者，在成功接受Crizotinib治療5個月后對該藥產(chǎn)生耐藥，并且研究者在該患者中發(fā)現(xiàn)兩處新的突變，即4374G→A和4493C→A。2個堿基突變分別導(dǎo)致了氨基酸C1156Y和L1196M的改變，從而影響ALK與Crizotinib或ATP的結(jié)合，并且L1196M突變導(dǎo)致的耐藥性比 C1156Y更強(qiáng)。Zhang等運(yùn)用加速突變基因的策略來檢測對Crizotinib耐藥的ALK突變，應(yīng)用體外基因掃描技術(shù)成功地檢測出L1196M，C1156Y和F1174L的改變，并且研究者使用1種更有效的ALK抑制劑TAE684來克服Crizotinib產(chǎn)生的耐藥［29］。最近，有研究表明 另 外 3 種 ALK 抑 制 劑 AP26113［30］，CH5424802［31］，X-396［32］都能選擇性地抑制 L1196M突變導(dǎo)致的耐藥。Ryohei Katayama等［30］為研究腫瘤細(xì)胞是如何產(chǎn)生耐藥，運(yùn)用大劑量的Crizotinib作用于EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC的細(xì)胞系直至其產(chǎn)生耐藥，從而建立了耐藥模型，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)產(chǎn)生耐藥性以后，EML4-ALK基因擴(kuò)增，高劑量抑制劑使L1196M基因發(fā)生突變從而導(dǎo)致耐藥，在隨后的研究中，他們發(fā)現(xiàn)了另外2種結(jié)構(gòu)不同的 ALK抑制劑，NVP-TAE684和 AP26113。其中，NVPTAE684明顯減少了H3122和H3122CR細(xì)胞系的存活力，這與H3122和H3122CR細(xì)胞系Crizotinib產(chǎn)生耐藥形成了鮮明的對比。而AP26113與Crizotinib相比，其在細(xì)胞內(nèi)的作用強(qiáng)度高于Crizotinib5倍，同時AP26113在EML4-ALK陽性或者突變的Ba/F3細(xì)胞系中都表現(xiàn)出高度活性。同時，在二期試驗中，這些耐藥細(xì)胞對于Hsp90抑制劑17-AAG高度敏感。

EML4-ALK是NSCLC中1種新的分子靶點，EML4-ALK融合基因陽性的患者具有獨特的臨床病理特性，近期發(fā)現(xiàn)的EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變共存型患者中有許多尚未明確地問題值得研究，如不同病例對EGFR TKIs反應(yīng)不一致的原因，采用何種藥物對基因共存體患者進(jìn)行更好地靶向治療等。目前檢測EML4-ALK融合基因的技術(shù)有多種，但是還沒有1種金標(biāo)準(zhǔn)，如何應(yīng)用更加靈敏準(zhǔn)確的技術(shù)，檢測出該具有該融合基因的NSCLC患者更好地進(jìn)行靶向治療是面臨的挑戰(zhàn)之一。初步的研究表明ALK抑制劑Crizotinib(PF-02341066)治療EML4-ALK陽性的NSCLC患者療效顯著，該藥物的Ⅲ期臨床試驗正在進(jìn)行，隨著藥物的使用而不可避免的產(chǎn)生耐藥性也是值得關(guān)注的問題，有關(guān)耐藥的機(jī)制，耐藥后患者該如何進(jìn)行治療等都需進(jìn)一步研究，從而使患者更好地受益，真正實現(xiàn)個體化的靶向治療。

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