植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因在大腸桿菌中表達(dá)

龔鋼明，何婷婷，2，高 能

（1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，上海 201418；2.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

亞硝酸鹽還原酶（Nitritereductases）是催化亞硝酸鹽還原的酶。亞硝酸鹽廣泛存在于傳統(tǒng)腌臘肉制品和腌漬蔬菜中，近年來(lái)大量施用氮肥也可導(dǎo)致蔬菜硝酸鹽和亞硝酸鹽含量升高[1-2]。亞硝酸鹽對(duì)人體有危害，它能與蛋白質(zhì)代謝物反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺。SUNJ等[3]研究發(fā)現(xiàn)0～50mmol/L亞硝酸鈉可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞分泌TGF和IL-6等細(xì)胞因子，使癌細(xì)胞增殖。隨著亞硝酸鹽對(duì)人體危害的認(rèn)識(shí)不斷進(jìn)展，食品中亞硝酸鹽污染狀況及如何防治也成為食品安全問(wèn)題的熱點(diǎn)之一。利用微生物及其酶降低或消除食物中亞硝酸鹽的研究逐漸受到重視。目前這方面研究較多的是關(guān)于分解亞硝酸鹽的乳酸菌分離及乳酸菌發(fā)酵中亞硝酸鹽含量的變化規(guī)律[4-6]。此外，鄭懷忠等[7]研究了巨大芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)亞硝酸還原酶的條件優(yōu)化和酶在食品中應(yīng)用。NEUBAUERH[8]在發(fā)酵香腸中發(fā)現(xiàn)肉糖葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）能通過(guò)亞硝酸還原酶還原亞硝酸鹽。JACOBG等[9]從發(fā)酵香腸、煙熏烤腸和腌肉中，篩選出9種可以發(fā)酵產(chǎn)生亞硝酸還原酶的葡萄球菌（Staphylococcus）。但迄今有關(guān)乳酸菌亞硝酸鹽還原酶基因的的研究報(bào)道極少。

論文以植物乳桿菌基因組為模板，擴(kuò)增出亞硝酸鹽還原酶基因，再連接到表達(dá)載體上，經(jīng)鑒定、轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)，擬獲得亞硝酸鹽還原酶基因克隆和具有酶活性的重組表達(dá)蛋白。這對(duì)于研究亞硝酸鹽還原酶性質(zhì)及其應(yīng)用途徑提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

T4DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶（BamHⅠ、XhoⅠ）購(gòu)自Fermentas公司；DNA Marker；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、IPTG購(gòu)自上海生工生物公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Biomige公司；亞硝酸鹽還原酶總活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于GENMED公司。其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）h2由上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）TG1、BL21（DE3）；pET-32a（+）質(zhì)粒由天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院提供。

1.1.3 PCR引物

[10-11]，根據(jù)不同類(lèi)型NiR的保守序列設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列為：

P1 5′-GCGGATCCATGAGTCAAAGCTTATG-3′（下劃線BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；

P2 5′-CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTG-3′（下劃線XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。引物由北京六和華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒構(gòu)建

提取植物乳酸菌基因組DNA用作模板，加引物P1、P2進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：90℃，4min；94℃，45s；61℃，45s；72℃，45s；30個(gè)循環(huán)；72℃，10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。純化PCR產(chǎn)物，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，與經(jīng)相同限制酶酶切的pET-32a（+）質(zhì)粒連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、凝膠電泳鑒定和質(zhì)粒PCR、凝膠電泳鑒定，成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-30a（+）-nir-Lp。具體操作分別參照相應(yīng)的產(chǎn)品說(shuō)明和參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)

參照文獻(xiàn)[12]將pET-30a（+）-nir-Lp轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)后用PCR鑒定，篩選含質(zhì)粒pET-32a（+）-nir-Lp的陽(yáng)性菌株以1:100接入LB培養(yǎng)基（含50μg/mL氨芐青霉素），35℃培養(yǎng)至OD600為0.5時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mmol/L，200r/min繼續(xù)培養(yǎng)4h，誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)液4℃，5000r/min離心15min收集菌體，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值為7.4）洗滌2次，再重懸于緩沖液中，用超聲波法破碎細(xì)胞，4℃、10000r/min離心15min收集上清液，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。

1.2.3 粗酶液的活性測(cè)定

方法1.2.2中破碎菌體離心收集的上清液即可作為粗酶液。用細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)粗酶液的酶活性。具體操作按照該試劑盒使用說(shuō)明。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增

用PCR擴(kuò)增出亞硝酸鹽還原酶目的基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1），在接近1600bp處出現(xiàn)單一的條帶，該基因初步認(rèn)定為目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification of the targeted gene

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

PCR產(chǎn)物用純化試劑盒純化，經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后，與載體pET-32a（+）連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），篩選陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果中可獲得一個(gè)約1600bp插入片段和約6000bp片段（圖2）。這與預(yù)期結(jié)果相符合，表明目的基因已經(jīng)連接到載體pET-32a（+）上。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-32a（+）-nir-Lp。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖Fig.2 Double restriction enzyme digestion of recombinant plasmid

2.3 重組質(zhì)粒表達(dá)與目的蛋白鑒定

用重組質(zhì)粒pET-32a（+）-nir-Lp轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，制備菌體裂解蛋白的樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析（圖3），圖中顯示出一個(gè)特異性蛋白條帶（箭號(hào)所指處），而對(duì)照組沒(méi)有顯示該特異性條帶。據(jù)此可認(rèn)重組質(zhì)粒攜帶的基因獲得了表達(dá)。所出現(xiàn)的特異性條帶可能是亞硝酸鹽還原酶蛋白。

圖3 SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)Fig.3 Analysis of expression of recombinant proteins by SDS-PAGE

2.4 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物酶活性測(cè)定

用細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶活性檢測(cè)試劑盒（GENMED公司）對(duì)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和非誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物（陰性對(duì)照）的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。陰性對(duì)照樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示在0～300s測(cè)定時(shí)間段OD600值沒(méi)有明顯變化，而重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的樣品在測(cè)定時(shí)間0～300s段，OD600值發(fā)生了明顯變化。這表明重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物具有亞硝酸鹽還原酶的活性。該試劑盒檢測(cè)原理是亞硝酸鹽還原酶催化NaNO2與還原型甲基紫精（藍(lán)色）反應(yīng)生成氧化型甲基紫精（無(wú)色）。反應(yīng)液的OD600值大小與還原型甲基紫精和NaNO2的含量稱(chēng)正比。

圖4 目的基因表達(dá)產(chǎn)物的酶活測(cè)定結(jié)果Fig.4 Enzyme activity of expression product

3 討論

從研究腌制蔬菜等發(fā)酵過(guò)程中的亞硝酸鹽的變化中發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌具有消除亞硝酸鹽的能力。利用這些菌種人工接種發(fā)酵食品能有效控制腌制品中亞硝酸鹽的含量以保障這類(lèi)食品安全[13-14]。關(guān)于乳酸菌發(fā)酵消除亞硝酸鹽的機(jī)制還沒(méi)完全闡明。據(jù)張慶芳等[15]的研究認(rèn)為乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解作用分為酶促反應(yīng)和酸反應(yīng)兩個(gè)階段，在發(fā)酵初期pH值大于4.5時(shí)，亞硝酸鹽降解作用主要是以亞硝酸還原酶的酶促反應(yīng)為主，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸菌產(chǎn)生大量乳酸，使培養(yǎng)液pH值降低，當(dāng)pH值小于4.0后，亞硝酸鹽迅速分解，并且這種降解作用隨著pH值的降低而增強(qiáng)，因此推斷在乳酸菌發(fā)酵后期，亞硝酸鹽的降解主要以酸降解為主。但OH CK等[16]研究發(fā)現(xiàn)分離自韓國(guó)泡菜的植物乳桿菌在發(fā)酵時(shí)亞硝酸鹽的消除很大程度上取決于溫度，而不是pH值，乳酸的作用相對(duì)較小。從克隆和表達(dá)乳桿菌亞硝酸鹽還原酶結(jié)構(gòu)基因的角度進(jìn)行探索。實(shí)驗(yàn)用的植物乳桿菌經(jīng)過(guò)鹽酸萘乙二胺法檢測(cè)結(jié)果顯示有較強(qiáng)的亞硝酸鹽還原能力[17]。從該菌株基因組中克隆出了假定的亞硝酸鹽還原酶基因，并成功插入到大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)pET-32a（+）載體中。所構(gòu)建了的重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌和IPTG誘導(dǎo)，克隆的目的基因有效表達(dá)了重組目的蛋白，對(duì)表達(dá)菌體蛋白采用了亞硝酸鹽還原酶總活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)假定亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)的目的蛋白有顯著的還原亞硝酸鹽的功能。據(jù)此認(rèn)為這個(gè)表達(dá)蛋白是亞硝酸鹽還原酶。進(jìn)而表明該乳桿菌基因組中包含有亞硝酸鹽還原酶的基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為深入探討植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶奠定重要的基礎(chǔ)。

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