貓棒束孢真菌液體發(fā)酵工藝研究

楊喜花，張生萬 *，任連生

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西省腫瘤研究所比較醫(yī)學(xué)部，山西 太原 030013）

貓棒束孢（Isaria felina）是從天然冬蟲夏草子實(shí)體中經(jīng)菌種分離后培養(yǎng)得到的一株真菌，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所郭英蘭教授鑒定為Isaria felina（DC.：Fr.）Fr.，在分類上屬于半知菌綱、叢梗孢目、棒束孢屬。該菌種已被中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏（保藏號(hào)：CGMCCNO.0706），是一種新的冬蟲夏草菌種。國內(nèi)外目前關(guān)于貓棒束孢的研究報(bào)道較少。郭永霞從貓棒束孢菌絲體中分離純化得到具有抗真菌作用的環(huán)縮肽isarfelin，并對(duì)isarfelin進(jìn)行了理化性質(zhì)的分析、結(jié)構(gòu)鑒定，并發(fā)現(xiàn)isarfelin具有抑制細(xì)菌、抵抗真菌的活性[1]。BAUTER、Deffieux G等從貓棒束孢中提取分離得到環(huán)羧酚酸肽結(jié)構(gòu)的具有殺蟲作用的成分Isariins B，C和D，并對(duì)Isariins B，C和D的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定[2-3]。IKUMOTOT等研究發(fā)現(xiàn)Isaria felina的浸出液對(duì)離體心房有負(fù)收縮效應(yīng)，同時(shí)對(duì)電刺激回腸的收縮反應(yīng)及人血小板的凝結(jié)有抑制作用[4]。天然冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥，具有保肺益腎等補(bǔ)益功能[5-6]，對(duì)腎臟組織有一定的保護(hù)和修復(fù)作用，臨床上多用于慢性腎病的治療[7]，由于天然冬蟲夏草價(jià)格昂貴，現(xiàn)一般多用從天然冬蟲夏草中分離得到的菌種經(jīng)人工培養(yǎng)獲得的菌絲體代替，如百令膠囊、金水寶膠囊等[8]。而我們前期研究結(jié)果表明，貓棒束孢對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰及甘油誘導(dǎo)的急性腎衰均有很好的治療作用，因此貓棒束孢具有遠(yuǎn)大的開發(fā)應(yīng)用前景，有希望開發(fā)為腎病治療藥物。本文就貓棒束孢的液體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究，從而可以增加貓棒束孢的產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)貓棒束孢提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

貓棒束孢菌種，于山西省腫瘤研究所比較醫(yī)學(xué)部保藏。

1.2 試劑

蛋白胨，酵母膏，酵母粉，蔗糖，硫酸鎂，磷酸二氫鉀，碳酸氫鈉。

1.3 主要儀器

HZ-9310K型全溫振蕩器：太倉市科技器材廠；光學(xué)顯微鏡：日本Olympus CX21FS1；筆式pH計(jì)：上海虹益器材儀表有限公司；生物安全柜：青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；低速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司KDC-2044；876-1型真空干燥箱：上海新諾儀器廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將一定體積的培養(yǎng)基裝于3000mL三角瓶中，牛皮紙封口，125℃高壓滅菌40min，冷卻至室溫，接入菌種，置于180r/min搖床上，于一定溫度條件下旋轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液于2000r/min離心5min，得菌絲體及上清液，分別于80℃烘24h，測(cè)干重。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基的選擇

將貓棒束孢菌種分別接種于培養(yǎng)基1（蛋白胨0.6%，酵母膏1.2%，蔗糖2.4%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5～7.0）和培養(yǎng)基2（蛋白胨0.6%，酵母粉1.2%，蔗糖2.4%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5～7.0）中，于26.5℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h，分別收集菌絲體及上清液，于80℃烘干24h，測(cè)干重。結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)基篩選結(jié)果Table 1 Result of screening medium

由表1可見，使用培養(yǎng)基1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)貓棒束孢，其菌絲體及上清液得率均優(yōu)于培養(yǎng)基2，這與酵母膏與酵母粉的成分不同有關(guān)。酵母粉沒有經(jīng)過分解，是酵母液體純培養(yǎng)干燥后的一種性狀，可以做為蛋白原料理解；而酵母膏的營養(yǎng)物質(zhì)得到過分解，是酵母破壁以后除去酵母細(xì)胞壁以后的細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)，主要成分是氨基酸、肽、核甘酸、B族維生素等，再復(fù)配微量元素、P源等營養(yǎng)元物質(zhì)而成，可按照微生物培養(yǎng)基的概念去理解。

2.2 培養(yǎng)基裝量的選擇

將貓棒束孢菌種接種于培養(yǎng)基1裝量分別為1000mL、800mL、500mL、300mL的3000mL的三角瓶中，于26.5℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h，分別收集菌絲體及上清液，于80℃烘干24h，測(cè)干重。結(jié)果見表2。

表2 裝量篩選結(jié)果Table 2 Effect of culture medium volume on Isaria felina production

由表2可見，培養(yǎng)基裝量在500mL以上時(shí)，菌絲體及上清液的收率隨著裝量的增加反而降低，而培養(yǎng)基裝量在500mL以下時(shí)，菌絲體及上清液的收率卻隨著裝量的增加而增加。培養(yǎng)基裝量為500mL時(shí)，菌絲體得率及上清液收率均最高，故采用500mL裝量。

2.3 溫度對(duì)工藝的影響

將貓棒束孢菌種接種于培養(yǎng)基1裝量為500mL的300mL三角瓶中，分別于30℃、26.5℃、22℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h，分別收集菌絲體及上清液，于80℃烘24h，測(cè)干重。結(jié)果見表3。

表3 溫度篩選結(jié)果Table 3 Effect of culture temperature on Isaria felina production

由表3可見，在30℃和22℃時(shí)菌絲體生長(zhǎng)較慢，甚至不生長(zhǎng)，而在26.5℃時(shí)生長(zhǎng)較佳，說明菌絲體的生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境要求較為嚴(yán)格，在高溫和低溫環(huán)境中不易生長(zhǎng)。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)工藝的影響

將貓棒束孢菌種接種于培養(yǎng)基1裝量為500mL的3000mL三角瓶中，分別于26.5℃下發(fā)酵培養(yǎng)36h、48h、60h，收集菌絲體及上清液，于80℃烘24h，測(cè)干重。結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵時(shí)間篩選結(jié)果Table 4 Effect of culture time on Isaria felina production

由表4可見，發(fā)酵時(shí)間48h時(shí)，貓棒束孢菌絲體及上清液產(chǎn)率均較高，而發(fā)酵時(shí)為36h和60h時(shí)，貓棒束孢菌絲體及上清液產(chǎn)率均有所降低。

3 結(jié)論

經(jīng)過對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基裝量、溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素的考察，我們確定了貓棒束孢最佳發(fā)酵工藝：培養(yǎng)基為蛋白胨0.6%，酵母膏1.2%，蔗糖2.4%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)整pH值為6.5～7.0；培養(yǎng)基裝量為500mL，發(fā)酵溫度為26.5℃，發(fā)酵時(shí)間為48h。

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