響應面法優(yōu)化米曲霉降解黃水的營養(yǎng)條件

劉 丹 ，張志才,3*，馮 凡，李佳少，李 敏，龐巧霞，陳克平

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學 生命科學研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.北京綠科天成生物有限公司，北京 102300）

黃水是固態(tài)法生產(chǎn)濃香型大曲酒的發(fā)酵過程中，酒醅在微生物的作用下部分由水浸出的，由上層連續(xù)向窖底滲透的一種棕黃色、微粘稠的渾濁液體。該廢水含有較多的酚類、醇類化合物[1]，呈酸性，pH值為3.0～4.5[2]；其COD和BOD較高，遠超出了國家允許的廢水排放標準。如該廢水不經(jīng)處理直接排放至水體中，會降低水體中的溶氧量并且會阻礙水生生物的生長[3]，導致嚴重的環(huán)境污染。

目前為止，黃水的處理方法主要包括生物法和物理-化學法[3-4]，或者通過酯化、串蒸、生產(chǎn)調(diào)味酒等方式回收[5]。但是，回收方式只能回收一些較低沸點的具揮發(fā)性的酯類物質(zhì)[6]，該廢水仍需進一步處理。而物理-化學法處理黃水包括吸附，凝聚和絮凝、氧化法、膜處理以及蒸發(fā)等[3]。有資料顯示活性炭作為一種吸附劑可以達到99%的脫色效果[3]。也有研究表明在堿性條件下，生物法結(jié)合利用傳統(tǒng)凝聚劑如硫酸亞鐵、硫酸鐵或明礬處理廢水，98%的有色物質(zhì)可以被去除[3，7]。但是這些處理方法不僅成本較高，還會造成二次污染[8]。目前，生物法在廢水處理中起著主要作用，已被廣泛應用[9]。生物法處理是通過微生物的新陳代謝，降解廢水中的有機物，從而能顯著降低廢水的COD。與回收、物理-化學處理法相比，生物降解更環(huán)保，且高效、成本較低[10]。

米曲霉，屬半只菌亞門，可以分泌多種酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和植酸酶等[11-12]，已被美國食品藥品管理局和美國飼料控制官員協(xié)會認定為安全無毒[13-14]。目前米曲霉已被廣泛應用于廢水處理和水體修復、食品、飼料、曲酸生產(chǎn)、釀酒等發(fā)酵行業(yè)[12，15]。如TUNGTG等[16]人利用米曲霉處理木薯淀粉加工中的廢水，通過優(yōu)化降解條件，可以去除廢水中90%COD。BHALERAOTS和PURANIK PR[17]研究發(fā)現(xiàn)一株能降解土壤中久效磷的米曲霉ARIFCC1054，該菌具有磷酸酶活性，可用于修復被久效磷污染的土壤以及廢水的處理。另外，秸稈經(jīng)過粉碎后用米曲霉發(fā)酵，其纖維素和半纖維素可降低24.36%和69.90%[18]。除此之外，米曲霉也已被廣泛應用于重金屬的吸附或者染料的去除[19-20]。

在本文中，我們所利用的米曲霉CGMCC5992能有效降解黃水中的有機物質(zhì)并在發(fā)酵過程后期能產(chǎn)生活性物質(zhì)生物堿，生物堿能有效降低糖尿病誘導小鼠的血糖含量。本研究通過單因素試驗和Box-Behnken設(shè)計試驗優(yōu)化米曲霉CGMCC5992降解黃水中有機物質(zhì)，降低其COD的營養(yǎng)需求。而生物堿的結(jié)構(gòu)功能分析將在另撰文闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

米曲霉CGMCC5992為自主分離菌株，被保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 黃水

黃水：由江蘇洋河酒廠提供，常溫保存。黃水為棕褐色，有典型氣味，呈酸性（pH值為3.5），化學需氧量（COD）為40g/L～45g/L，生物需氧量（BOD）為15g/L～20g/L，氨氮濃度為0.2mg/L～0.5mg/L，懸浮體濃度為165mg/L～200mg/L。

1.2 種子液的制備

從斜面上取一環(huán)該菌接種于無菌的固體培養(yǎng)基中（含15g麩皮，20mL水），在28℃靜置培養(yǎng)4d～7d。然后取該種子轉(zhuǎn)接至含有100mLPD培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃、150r/min下?lián)u床培養(yǎng)1d～2d作為種子液用于黃水降解。

1.3 黃水的生物降解

以10%黃水作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并按照試驗設(shè)計方法添加各種營養(yǎng)物質(zhì)，通過促進米曲霉的生長討論對其COD的影響。培養(yǎng)基于121℃下滅菌30min。冷卻后，接種10%（v/v）上述制備的種子液，在28℃、150r/min搖床培養(yǎng)5d。每隔24h，測定發(fā)酵液的pH值，同時取1mL發(fā)酵液在6000r/min下離心5min，取上清液用于COD的分析。

1.4 試驗設(shè)計

選擇不同的氮源、無機鹽、維生素進行試驗，確定對米曲霉CGMCC5992降解黃水有機物質(zhì)有顯著影響的單因素。并在單因素試驗基礎(chǔ)上，應用3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計，以發(fā)酵液的COD為響應值，采用響應面法進行分析，實驗因素及水平安排見表1。

1.5 分析方法

COD采用酸性高錳酸鉀法測定[21]，pH值用pH計在無菌條件下測定。響應面試驗結(jié)果運用Expert Design 8.0.4分析軟件進行方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 氮源對黃水COD的影響

由于黃水中含有較多的有機酸、醇類、酯類，其可作為米曲霉生長的足夠碳源，故試驗中未選擇碳源作為優(yōu)化因素。為研究不同氮源對米曲霉CGMCC5992去除黃水COD的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加100mg/L的尿素、蛋白胨、硝酸鉀、氯化銨作為不同的氮源，進行發(fā)酵試驗。實驗結(jié)果如圖1所示，因尿素和蛋白胨是有機氮源，故黃水起始COD要高于另外2個無機氮源。在第4d，添加尿素和蛋白胨后的黃水COD低于其他2種氮源，這表明前者降解有機物質(zhì)的速率要高于其他2種氮源添加物。另外，最后一天添加尿素作為氮源的黃水COD低于添加蛋白胨。故綜合考慮，選擇尿素作為最佳氮源。隨后考察添加不同濃度尿素對COD的影響。結(jié)果如圖2所示，在第5d，當尿素濃度為0.3g/L時，其COD值低于其它濃度。盡管添加氮源種類不同，但在菌絲體生長過程中黃水pH的趨勢相同，隨著黃水中有機酸被降解，pH值從3.5上升至7.0左右。

2.1.2 無機鹽對黃水COD的影響

為考察添加無機鹽對黃水COD的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加10mg/L MnSO4、MgSO4、Fe2（SO4）3及ZnSO4這4種無機鹽。以不添加無機鹽作為對照組。其結(jié)果表明添加ZnSO4的黃水最后COD最低，見圖3。有資料顯示鋅離子是多種水解-合成酶的輔助因子，對糖類、蛋白質(zhì)和核酸的水解有著重要影響[22]。隨后選擇不同的鋅離子濃度作為變量，考察其對黃水的pH值、COD的影響。結(jié)果如圖4顯示，在鋅離子濃度為20mg/L時，其黃水COD濃度低于其他濃度。結(jié)果表明低濃度的鋅離子對米曲霉降解黃水起著促進作用。如圖3所示，添加無機鹽的黃水其pH變化趨勢與添加氮源的趨勢類似。

圖1 不同氮源對黃水的pH值和COD的影響Fig.1 Effect of nitrogen sources on pH value and COD of vinasse

圖2 不同濃度尿素對黃水pH值和COD的影響Fig.2 Effect of urea concentrations on pH value and COD of vinasse

圖3 不同無機鹽對黃水pH值和COD的影響Fig.3 Effect of inorganic salts on pH and COD of vinasse

2.1.3 維生素對黃水COD的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加10mg/L VB1、VB2、VB6、VC作為不同的生長因子。如圖5所示，添加不同維生素后，黃水的COD在第3d～5d明顯下降。在選擇的4種維生素中，添加VB6后黃水COD最低，降至471mg/L。故選擇VB6作為最佳生長因子添加。并進一步考察其不同濃度對黃水COD值和pH值的影響，結(jié)果如圖6所示，第5d，在VB6為20mg/L時COD最低。

圖4 不同濃度ZnSO4對黃水pH值和COD的影響Fig.4 Effect of ZnSO4concentration on pH value and COD of vinasse

圖5 不同維生素對黃水pH值和COD的影響Fig.5 Effect of vitamins on pH and COD of vinasse

圖6 不同濃度VB6對黃水p H值和COD的影響Fig.6 Effect of concentrations of VB6on pH and COD of vinasse

2.2 響應面分析

基于單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計原理，選擇尿素、ZnSO4和VB6為自變量，以COD為響應值設(shè)計了3因素3水平的響應面分析試驗。響應面試驗設(shè)計與結(jié)果見表1。

使用Design Expert7.0軟件，對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到擬合二次多項式回歸方程：

表1 Box-Behnken 的設(shè)計及結(jié)果Table 1 Box-Behnken design and results

由表3方程分析結(jié)果表明，該模型效應顯著可靠（p=0.0003）。方程中A、B、C、AB影響不顯著，AC、BC、A2、B2、C2影響都是顯著的。響應面模型的回歸系數(shù)R2為0.9872，說明該回歸方程回歸效果較好；R2adj為0.9641，說明可信度較高；失擬誤差p為0.3993，不顯著，表明該模型對試驗擬合情況較好，試驗誤差小，可以較好地反映各因素和響應值之間的真實關(guān)系。

表2 Box-Behnken 試驗方差分析Table 2 Regression analysis of Box-Behnken design

根據(jù)回歸分析分別繪制響應面圖，分析各因素間的交互作用。

圖7顯示了在VB6濃度為20mg/L時，尿素和ZnSO4對黃水COD的交互影響。從圖中可看出，在ZnSO4濃度不變的條件下，隨著尿素濃度逐漸增加，COD值出現(xiàn)先下降后上升的趨勢且變化較顯著。而在尿素濃度不變的條件下，隨著ZnSO4濃度的增加，COD值也出現(xiàn)了先下降后上升的趨勢，但變化不大。

圖8 尿素和VB6對黃水COD影響的響應面圖Fig.8 Response surface plot for effect of urea and VB6on COD

圖8顯示在20mg/L ZnSO4下，尿素和VB6對黃水COD的交互影響。尿素濃度在0.25g/L～0.30g/L范圍內(nèi)，隨著其濃度的增加，COD逐漸降低，在尿素濃度為0.28g/L～0.32g/L范圍內(nèi)，VB6為15mg/L～25mg/L COD達到最低。結(jié)果表明優(yōu)化后COD去除率提高。

圖9 ZnSO4和VB6對黃水COD影響的響應面圖Fig.9 Response surface plot for effect of ZnSO4and VB6on COD

圖9顯示了在尿素0.3g/L下，VB6和ZnSO4對黃水COD的交互影響。在ZnSO4濃度不變的條件下，隨著尿素濃度逐漸增加，COD值出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，變化較顯著。在尿素濃度不變的條件下，隨著ZnSO4濃度的增加，COD值也出現(xiàn)了先下降后上升的趨勢，但變化不大。

3 結(jié)論

（1）通過單因素試驗確定了影響米曲霉降解黃水效率的最佳濃度的氮源、無機鹽、維生素添加物，分別為尿素0.3g/L、ZnSO420mg/L、VB620mg/L。

（2）在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計，應用響應面法優(yōu)化米曲霉降解黃水的條件，得到最佳培養(yǎng)基組成為：在10%黃水中添加0.30g/L尿素，20.73mg/L ZnSO4和19.79mg/L VB6。在該條件下，黃水的COD最后降至323mg/L。結(jié)果表明優(yōu)化后COD顯著降低。

（3）試驗證明米曲霉CGMCC5992能有效降解黃水中的有機物質(zhì)，從而降低其COD。黃水通過米曲霉處理，隨著COD的降低，pH值也有所升高。但米曲霉降解黃水的機制還有待進一步研究。

[1]STRONG P J,BURGESS J E.Fungal and enzymatic remediation of a wine lees and five wine-related distillery wastewaters[J].Bioresource Technol，2008，99（14）：6134-6142.

[2]CARVAJAL-ZARRABAL O,NOLASCO-HIPóLITO C,BARRADASDERMITZ D M,et al.Treatment of vinasse from tequila production using polyglutamic acid[J].J Environ Manage，2012，95（Suppl）：66-70.

[3]SATYAWALI Y,BALAKRISHNANET M.Wastewater treatment in molasses-based alcohol distilleriesfor COD and color removal:a review[J].J Environ Manage，2008，86（3）：481-497.

[4]PANT D,ADHOLEYA A.Biological approaches for treatment of distillery wastewater:a review[J].Bioresource Technol，2007，98（12）：2321-2334.

[5]曹新莉，王明山.白酒生產(chǎn)中黃水和酒尾的應用[J].釀酒科技，2008，172（10）：96-99.

[6]譚光訊，李 凈.黃水的組分分析及應用研究進展[J].釀酒科技，2010，196（10）：90-92.

[7]PANDEY R A,MALHOTRA S,TANKHIWALE A,et al.2003.Treatment of biologically treated distillery effluent-a case study[J].Int J Environ Stud，2003，60（3）：263-275.

[8]SANTANA V S,FERNANDESMACHADON RC.2008.Photocatalytic degradation of the vinasse under solar radiation[J].Catal Today，2008，133-135：606-610.

[9]FREITASA C,FERREIRA F,COSTA A M,et al.Biological treatment of the effluent from a bleached kraft pulp mill using basidiomycete and zygomycete fungi[J].Sci Total Environ，2009，407（10）：3282-3289.

[10]ZHOU JIANGYA,YU XIAOJUAN,DING CONG,et al.Optimization of phenol degradation byCandidatropicalisZ-04 using Plackett-Burman design and response surface methodology[J].J Environ Sci，2011，3（1）：22-30.

[11]孫春華，燕 磊，常維山.不同碳源和氮源對米曲霉產(chǎn)酶影響的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2007，20（5）：986-989.

[12]趙龍飛，徐亞軍.米曲霉的應用研究進展[J].中國釀造，2006，25（3）：8-10.

[13]MARUIJ,OHASHI-KUNIHIRO S,ANDO T,et al.Penicillin biosynthesisinAspergillusoryzaeand itsoverproduction by genetic engineering[J].J Biosci Bioeng，2010，110（1）：8-11.

[14]MATSUMURA K,OBATA H,HATA Y,et al.Isolation and characterization of a novel gene encodingα-l-arabinofuranosidase fromAspergillusoryzae[J].J Biosci Bioeng，2004，98（2）：77-84.

[15]KAMMOUN R,NAILIB,BEJARS.Application of a statistical design to the optimization of parameters and culture medium forα-amylase production byAspergillus oryzaeCBS 819.72 grown on gruel(wheat grinding by-product)[J].Bioresource Technol，2008，99（13）：5602-5609.

[16]TUNG T Q,MIYATA N,IWAHORIK.Growth ofAspergillus oryzaeduring treatment of cassavastarch processing wastewater with high content of suspended solids[J].J Biosci Bioeng，2004，97（5）：329-335.

[17]BHALERAO T S,PURANIK PR.Microbial degradation of monocrotophosbyAspergillusoryzae[J].Int Biodet Biodegr，2009，63（4）：503-508.

[18]CHANGJUAN,CHENGWEI,YIN QINGQIANG,et al.Effect of steam explosion and microbial fermentation on cellulose and lignin degradation of corn stover[J].Bioresource Technol，2012，104：587-592.

[19]PARSHETTIG K,KALME SD,GOMARE SS,et al.Biodegradation of reactive blue-25 byAspergillus ochraceusNCIM-1146[J].Bioresource Technol，2007，98（18）：3638-3642.

[20]YANG YUYI,JIN DANFENG,WANG GUAN,et al.Competitive biosorption of acid blue 25 and acid red 337 onto unmodified and CDAB-modified biomass ofAspergillus oryzae[J].Bioresource Technol，2011，102（16）：7429-7436.

[21]國家環(huán)境保護總局，水和廢水監(jiān)測分析方法編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）[M].北京：中國環(huán)境科學出版社，2002：363.

[22]方一豐，林逢凱，陸 柱.補加營養(yǎng)元素對活性污泥法處理工業(yè)廢水的優(yōu)化作用[J].水處理技術(shù)，2006，32（10）：15-18.