銀合歡種子多糖提取工藝優(yōu)化

郭守軍，楊永利，李浩龍，葉文斌，黃錦霞

（1.韓山師范學(xué)院 生物系，廣東 潮州 521041；2.隴南師范高等?？茖W(xué)校，甘肅 成縣 742500）

銀合歡[Leucaena leucocephala（Lam.）de Wit]是豆科含羞草亞科銀合歡屬多年生灌木，主要特性是抗逆、速生、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及其適應(yīng)性強(qiáng)[1]。原產(chǎn)熱帶美洲，現(xiàn)廣布于熱帶地區(qū)，中國(guó)臺(tái)灣、福建、廣東、海南、香港、廣西、湖南、貴州、四川（西南部）和云南等地有栽培。銀合歡種子多糖主要成分是半乳甘露聚糖，是植物的儲(chǔ)備性多糖，主要存在于豆科植物種子的胚乳中，具有較強(qiáng)的吸水和保水能力，可作為增稠劑、凝膠劑、穩(wěn)定劑和凝聚劑等廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等許多工業(yè)領(lǐng)域[2-4]。近年來的研究表明，半乳甘露聚糖膠具有抗凝、纖維蛋白溶解、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)儭⒖共《?、降血糖、降膽固醇和減肥等作用[5-6]。所以半乳甘露聚糖型植物多糖的研究近年來倍受眾多國(guó)外學(xué)者與制藥廠商的關(guān)注。銀合歡種子多糖的流變性研究表明，銀合歡種子多糖具有良好的耐鹽穩(wěn)定性，在酸和堿性條件下也具有良好的穩(wěn)定性，故銀合歡種子多糖可添加在醬油、醋等高鹽食品和酸性堿性食品中[7]。

本研究通過單因素和L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)熱水浸提法提取銀合歡種子多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為銀合歡種子多糖的進(jìn)一步開發(fā)研究和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1.1 主要材料和試劑

銀合歡種子購于云南省林木種苗站，葡萄糖（純度＞99.99%）購于Sigma公司；苯酚、濃硫酸、95%vol乙醇均為分析純。

1.1.2 主要儀器

SL320N電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），TDL-5000B型低速冷凍大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦滬西儀器廠），HJ-6A六聯(lián)恒溫磁力攪拌器（金壇市宏華儀器廠），LGJ-18型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠），9101微型高速樣品粉碎機(jī)（北京檢測(cè)儀器有限公司）；UV-2800型紫外可見光分光光度計(jì)（尤尼卡上海儀器有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀合歡種子多糖的提取流程

銀合歡種子在50℃烘干后將其粉碎，稱取10g用無水乙醇回流脫脂，再在50℃時(shí)干燥，然后加入一定量的水，在一定溫度條件下進(jìn)行一定時(shí)間的提取，提取液經(jīng)過減壓濃縮得濃縮液，加乙醇醇析得粗多糖沉淀，抽濾，沉淀分別用甲醇、丙酮依次洗滌，冷凍干燥后得多糖產(chǎn)品。

1.2.2 銀合歡種子多糖含量的測(cè)定方法

本實(shí)驗(yàn)采用苯酚—硫酸法測(cè)定總的多糖含量[8]。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

料液比采用1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 7個(gè)水平，浸提溫度采用40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃6個(gè)水平，浸提時(shí)間采用1h、2h、3h、4h、5h、6h，乙醇濃度為70%vol、75%vol、80%vol、85%vol、90%vol、95%vol 6個(gè)水平分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定3因素3水平L9（33）作正交試驗(yàn)，確定提取銀合歡種子中可溶性多糖的最佳提取工藝參數(shù)，用苯酚—硫酸法測(cè)定多糖含量，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 核酸、蛋白質(zhì)的檢測(cè)[8-9]

多糖水溶液在波長(zhǎng)200nm～400nm處掃描，在260nm及280nm處檢測(cè)有無吸收峰，茚三酮法顏色檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行方差分析和SSR顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖含量的測(cè)定[10-11]

在試驗(yàn)條件下，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，為吸光度值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，計(jì)算回歸方程：y=5.1086x+0.0061，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。多糖提取率=V×C×f×W2/（W3×W1）×100%。W1：稱取干銀合歡種子粉末的質(zhì)量（g）；W2：由W1提取的粗多糖的質(zhì)量（g）；W3：從W2中稱取的用于分析測(cè)定的粗多糖質(zhì)量（g）；V：溶解W3定容后的體積（L）；f：多糖的校正系數(shù)[16]，f≈0.9；C：由回歸方程計(jì)算所得多糖的濃度（g/L）。

2.2 影響銀合歡種子多糖提取率的單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響

料液比影響著物料的溶解度，當(dāng)料液比偏低時(shí)，物料得不到充分的浸泡，多糖在提取溶劑中容易飽和，導(dǎo)致提取不充分；料液比偏高時(shí)，雖然提取可能較為充分，但是過高料液比的會(huì)造成濃縮時(shí)能耗的增加和醇沉?xí)r乙醇的大量浪費(fèi)。料液比單因素試驗(yàn)見圖2，隨著料液比的升高銀合歡種子多糖的溶出量呈逐漸升高的趨勢(shì)，多糖的得率也在增加，在料液比為1:35時(shí)，多糖的提取得率達(dá)到最大，為8.635%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 料液比對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharide

2.2.2 溫度對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響

話音未落，將軍右掌一拍幾案，身形暴起。幾案上的棋子受那一掌之力，立即飛起，未及落地，將軍右手五指連彈，把飛起的棋子盡數(shù)彈出。

固定提取料液比為1:35、時(shí)間為1h、95%vol乙醇進(jìn)行醇沉（3倍于提取液總體積），考察不同溫度對(duì)多糖提取率的影響，見圖3，隨著提取溫度的升高，多糖得率逐漸升高，升高至60℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最大，之后逐漸下降。

圖3 溫度對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharide

2.2.3 時(shí)間對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響

處理時(shí)間對(duì)多糖的提取率的影響見圖4，在相同的最佳料液比和最佳溫度條件下，隨著熱浸提時(shí)間的增加，銀合歡種子中多糖提取率也在逐漸增加，浸提4.0h時(shí)多糖得率最高，之后稍有下降。

圖4 時(shí)間對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響Fig.4 Effect of time on extraction yield of polysaccharide

2.2.4 乙醇濃度對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響

乙醇（3倍于提取液體積）濃度對(duì)多糖的提取率的影響見圖5，隨著醇沉濃度的增加，銀合歡種子多糖提取率緩慢增加，但在95%vol的醇沉濃度下多糖提取率為最高，所以選取95%vol的乙醇為最優(yōu)醇沉濃度。

圖5 乙醇濃度對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響Fig.5 Effect of alcohol concentration on extraction yield of polysaccharide

2.3 銀合歡種子多糖提取率的正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果的直觀分析

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定3因素3水平作正交試驗(yàn)，因素水平、試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算及分析見表1。

從表1可知，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，比較各因素的極差結(jié)果R值，可以得知RC>RA>RB，說明提取時(shí)間是影響多糖提取率的最關(guān)鍵因素，其次是料液比，再次是提取溫度，主次順序?yàn)镃>A>B。得出最優(yōu)組合工藝為A2B2C3，即熱水浸提料液比為1:35，溫度為60℃，時(shí)間為5.0h，醇沉濃度為95%vol，多糖平均得率為12.155%。

2.3.2 正交試驗(yàn)的方差分析

正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果（表2）顯示，時(shí)間因素對(duì)銀合歡種子多糖提取率影響差異極顯著，對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響起最主要作用，溫度和料液比在此試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)銀合歡種子多糖提取率影響差異顯著，對(duì)銀合歡種子多糖提取率的影響起次要作用，溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較小。這與直觀分析結(jié)果是相一致的。

表1 銀合歡種子多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Result and analysis of orthogonal test for polysaccharide extraction

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 2 ANOVA of orthogonal test result for polysaccharide extraction

2.3.3 正交試驗(yàn)多重性比較

表3的SSR檢驗(yàn)顯示，3個(gè)水平間都沒有顯著差異，故選平均值最大的，即料液比的最佳工藝參數(shù)是1:35。

表3 提取料液比各水平間差異顯著性SSR 檢驗(yàn)Table 3 SSR differences significance of extract liquid ratio with various levels

表4的SSR檢驗(yàn)顯示，控制提取溫度非常重要，3個(gè)水平都沒有顯著差異，故選平均值最大的，即溫度的最佳工藝參數(shù)是60℃。

表4 提取溫度各水平間差異顯著性SSR 檢驗(yàn)Table 4 SSR differences significance of temperature with various levels

表5的SSR檢驗(yàn)顯示，控制提取時(shí)間非常重要，3與1水平間有顯著差異，故時(shí)間最佳工藝參數(shù)為5h。

表5 時(shí)間各水平間差異顯著性SSR 檢驗(yàn)Table 5 SSR differences significance of time with various levels

表6的SSR檢驗(yàn)顯示，控制乙醇濃度非常重要，3和2與1相比均有極顯著差異，故應(yīng)選擇乙醇最佳工藝的濃度為95%vol。

表6 乙醇各水平間差異顯著性SSR 檢驗(yàn)Table 6 SSR differences significance of ethanol with various levels

2.4 有關(guān)提取流程的其他討論

因?yàn)槭亲罴褍?yōu)化工藝，所以樣品粉碎后不易過篩，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過篩后的殘?jiān)写蟛糠譃榉N皮，而種皮內(nèi)表面附著胚乳，胚乳中含有大部分的多糖，所以在這樣條件下就能溶出胚乳中更多的多糖而不會(huì)浪費(fèi)材料，如此可提高粗多糖的提取率，所以樣品粉碎后不必過篩。再則多糖的醇析采用3倍量的95%vol乙醇，4℃靜置1h，沉淀比較完全。試驗(yàn)結(jié)束后采用菲林試劑進(jìn)行脫色，冷凍干燥后得到的多糖為白色粉末，質(zhì)量高于不除雜脫色工藝提取的多糖。

3 結(jié)論

3.1 銀合歡種子可溶性多糖不含蛋白、核酸。由于半乳甘露聚糖遇水溶脹，能產(chǎn)生很高的黏度，所以在多糖分散在水中之前，需要充分的溶脹。實(shí)際生產(chǎn)操作中，可以預(yù)先對(duì)種子在常溫下用水進(jìn)行浸泡，讓胚乳中多糖充分溶脹后再進(jìn)行加溫提取，可大大縮短提取時(shí)間，降低能耗。

3.2 在應(yīng)用中應(yīng)注意，銀合歡種子膠在冷水中的溶解度較低，約為50%，隨著溫度的升高，溶解度逐漸增加，并且加熱時(shí)間對(duì)其黏度影響較小，故可應(yīng)用于高溫加熱和較長(zhǎng)時(shí)間加熱的食品中。銀合歡種子膠溶液pH值為6.15，pH 3～11的范圍內(nèi)。其黏度變化較小，可應(yīng)用于陳醋等酸性食品及堿性食品加工中。鹽離子（Na+）濃度（5%和11%的NaCl溶液）對(duì)銀合歡種子膠溶液黏度的影響較小。加入食鹽后，膠溶液體系稍有波動(dòng)，48h后溶液的黏度保持穩(wěn)定。因此，銀合歡種子膠可以添加在番茄醬、甜面醬、午餐肉、蠔油和醬油等高鹽食品中[7]。

我國(guó)食用膠的年需求量為30000t～40000t，目前，我國(guó)自產(chǎn)食用膠量約為10000t左右，食用膠的缺口很大，只能靠進(jìn)口，因此，研發(fā)新型食用膠是當(dāng)務(wù)之急。銀合歡種子含有較多的水溶性多糖——半乳甘露聚糖，具有較好的增稠、穩(wěn)定、凝膠作用。而銀合歡又為多年生灌木，分布廣泛，其種子資源較為豐富，為半乳甘露聚糖膠生產(chǎn)的良好原料之一[10-12]。

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