Enterobacter sp.SYA2乳糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究

張衛(wèi)兵，張 炎，文鵬程，劉芳寧，巨 蕾，梁 琪*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

乳糖酶（Lactase）學(xué)名為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶（β-D-galactoside galactohydrolase，E.C.3.2.1.23），又名β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），是一類催化β-D-半乳糖苷鍵發(fā)生水解的酶，能將乳糖水解成半乳糖和葡萄糖[1]。乳糖酶來源豐富，可以從很多微生物、植物和動(dòng)物體中獲得。利用用微生物發(fā)酵法獲取乳糖酶的方法具有操作方便、生產(chǎn)效率高、適用于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[2]。

目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)乳糖酶微生物很多，其中包括黑曲霉（Aspergillusniger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、脆壁克魯維酵母（Kluyveromycesfragilis）、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、成團(tuán)腸桿菌（Enterobacter agglomerans）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus Circulans）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等[3-8]。不同微生物來源的乳糖酶性質(zhì)及用途不同：霉菌作用最適pH值偏酸性（pH2.5～5.0），主要用于酸性乳清和干酪的水解；酵母所產(chǎn)乳糖酶最適pH值近中性（pH6.0～7.0），適合于牛乳和甜乳清的加工處理；細(xì)菌所產(chǎn)的酶與酵母最適pH值接近且具有較高的耐熱性[9]。細(xì)菌具有體積小、繁殖快、發(fā)酵過程易控制等特點(diǎn)，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)有很大的潛力[10]。

本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期從甘肅省天祝牧區(qū)牦牛乳酸奶中分離的產(chǎn)乳糖酶菌株Enterobactersp.SYA2[11]為研究對(duì)象，對(duì)Enterobactersp.SYA2乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為其進(jìn)一步應(yīng)用和研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

ONP（分析純）：南京化學(xué)試劑有限公司；X-gal（色譜純）：西安舟鼎國生物技術(shù)公司；ONPG（色譜純）：科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：乳糖10g/L、蛋白陳10g/L、酵母膏3g/L、NaCl 3g/L，pH7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖15g/L、蛋白陳20g/L、酵母膏3g/L、NaCl 3g/L、K2HPO41g/L、MnCl 20.1g/L，pH 7.0。

1.1.3 儀器與設(shè)備

凈化工作臺(tái)（型號(hào)：SW-CJH-1FD）：蘇州凈化設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：HG303-4）：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；電子天平（型號(hào)：PB203-N）：上海精密科學(xué)儀器廠；數(shù)顯pH計(jì)（pHS-25）：上海精密科學(xué)儀器廠；低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：SUPRA 22K）：韓國HANSON技術(shù)公司；紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-2450）：日本島津公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（型號(hào)：JY96-ПNP）：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶液制備

將分離純化的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)8h制備種子液；將種子液按體積分?jǐn)?shù)5%接種于裝液量為50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速176r/min，37℃培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)后取培養(yǎng)液20mL，4℃、6000r/min離心20min，收集菌體并用0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液至20mL，超聲破碎15min，4℃、12000r/min離心20min，取上清液測(cè)定酶活。

1.2.2 硫酸銨分級(jí)沉淀

準(zhǔn)確量取一定體積的酶液，將其在冰水浴中，變緩慢攪拌，邊慢慢添加經(jīng)干燥和研磨的硫酸銨細(xì)粉末，使硫酸銨的飽和度達(dá)30%，4℃靜置12h后，在4℃、12000r/min條件下離心15min，取少量上清液測(cè)定酶活和蛋白含量，沉淀收集備用。準(zhǔn)確稱取一定體積的上清液，重復(fù)以上操作使硫酸銨飽和度達(dá)到50%、60%、70%、80%、90%、100%，測(cè)量各飽和度條件下上清液的乳糖酶活。當(dāng)硫酸銨分級(jí)沉淀的起始及終止飽和度確定后，硫酸銨鹽析按以下步驟進(jìn)行操作：在冰水浴條件下，變緩慢攪拌邊緩慢添加經(jīng)干燥和研磨的硫酸銨細(xì)粉末，使硫酸銨的飽和度達(dá)30%，緩慢攪拌混合2h后，在4℃、12000r/min條件下離心15min，棄去沉淀留取上清夜。繼續(xù)添加硫酸銨粉末至上清液中硫酸銨飽和度達(dá)90%，4℃靜置12h后，在4℃、12000r/min條件下離心15min，棄去上清液，用少量0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 透析

將經(jīng)過鹽析后的濃縮粗酶液置于透析袋中，在4℃緩慢透析24h，透析緩沖液為蒸餾水。用1%BaCl2溶液檢查硫酸銨是否透析完畢。

1.2.4 乳糖酶活力的測(cè)定

以O(shè)NPG為酶作用底物，參照文獻(xiàn)[12]并做適當(dāng)修改。取0.5mL稀釋后的酶液，37℃水浴5min，加入已預(yù)熱至37℃的含5mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）1.5mL，37℃水浴反應(yīng)10min，然后立即加入3.0mL 0.5mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于波長420nm處測(cè)定OD值，測(cè)定3次取平均值。以加熱失活的酶液作為空白。一個(gè)酶活力單位定義（U）為：在37℃每分鐘水解釋放1μmol ONP所需的酶量。

式中：X 為乳糖酶活力；C 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的ONP濃度；N 為稀釋倍數(shù)。

1.2.5 蛋白含量的測(cè)定

酶液中粗蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[13]。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取6支試管，分別加入0.1mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，然后用離子水補(bǔ)充到1mL，最后各試管中分別加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G250試劑。每加完一管，立即蓋塞輕搖試管使之混合，靜置顯色10min，于波長595nm處測(cè)定吸光度值。

（2）酶液測(cè)定：取1mL稀釋后的酶液，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G250試劑，靜置顯色10min，于波長595nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算蛋白含量。

式中：A 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的蛋白含量，mg；C 為測(cè)定時(shí)所用酶液體積，mL；D 為酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.6 最適作用溫度

底物ONPG溶液分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃保溫5min。酶液適當(dāng)稀釋后35℃保溫5min，在不同溫度分別加入ONPG溶液中，測(cè)定酶活，以獲得的最高酶活為100%。

1.2.7 熱穩(wěn)定性

酶液分別在35℃、40℃、45℃、50℃保溫10min、20min、30min、40min、50min、60min后，測(cè)定酶活，以未保溫酶液的酶活為100%。

1.2.8 最適作用pH值

ONPG分別用pH值為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9的緩沖液配制后，測(cè)定酶活，以獲得的最高酶活為100%。

1.2.9 pH值穩(wěn)定性

將酶液分別置于pH值為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9的緩沖液中，室溫靜置18h，用緩沖液調(diào)至最適pH值，分別測(cè)定酶活，以獲得的最高酶活為100%。

1.2.10 金屬離子酶活力的影響

用濃度為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+溶液處理酶液，在室溫放置40min，測(cè)定乳糖酶活力，以未添加金屬離子酶液的酶活為100%。

1.2.11 乳清水解試驗(yàn)

Enterobactersp.SYA2乳糖酶在40℃保溫10min，選擇加酶量為1Um/L和2Um/L（ONPG單位），在40℃水解乳糖，以乳糖水解率表示該酶的水解率。乳清中乳糖含量和葡糖糖含量的測(cè)定方法參照GB/T5009.7-2003。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS15.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。當(dāng)高濃度鹽存在時(shí)，一方面大量的水同鹽分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)沒有足夠的水維持溶解狀態(tài)，從而破壞了維持蛋白質(zhì)親水膠的水膜，蛋白容易沉淀出來；另一方面加入的鹽離子中和了蛋白質(zhì)分子表面的極性基團(tuán)所帶的電荷，減少了蛋白質(zhì)分子間的相互排斥力，蛋白質(zhì)分子相互碰撞發(fā)生聚集沉淀。一般而言，硫酸銨沉淀只是用于蛋白質(zhì)的初步純化，純化效果有限，但有利于酶液濃縮，以便于后續(xù)操作，所以一般選取較寬的硫酸飽和度范圍，以保證較高的回收率。

圖1 硫酸銨沉淀上清液中乳糖酶酶活的變化曲線Fig.1 Activity of lactase in supernatant during ammonium sulphate precipitation

硫酸銨分級(jí)沉淀過程中上清液中酶活力的變化情況見圖1，當(dāng)硫酸銨飽和度小于50%時(shí)，上清液中酶活力變化不明顯，表明在此飽和濃度下酶蛋白僅有少量沉淀。隨著硫酸銨飽和的的繼續(xù)增加，上清液中酶活力迅速下降，當(dāng)硫酸銨飽和度至85%時(shí)，上清液中基本已經(jīng)沒有酶液，此時(shí)酶蛋白已經(jīng)基本沉淀完全。因此，本試驗(yàn)選取分級(jí)沉淀硫酸銨飽和度為30%和85%。

附表 Enterobacter sp.SYA2 乳糖酶硫酸銨沉淀試驗(yàn)結(jié)果Attached table Ammonium sulphate precipitation of lactase produced by f Enterobacter sp.SYA2

由附表可以看出，Enterobactersp.SYA2乳糖酶粗酶液在未經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀前，相對(duì)酶活為28.31 U/mg，而經(jīng)硫酸銨沉淀后相對(duì)酶活達(dá)45.85 U/mg，說明硫酸銨對(duì)酶液起到一定的濃縮作用。

2.2 最適作用溫度

溫度是影響酶活性的主要因素之一，通常情況下各種酶都會(huì)有其最適作用溫度，在此溫度下酶的活力最高。如果溫度太高會(huì)影響酶蛋白的次級(jí)鍵，使蛋白質(zhì)變性，降低其酶活性；溫度過低，不利于酶的反應(yīng)進(jìn)程。

由圖2可知，Enterobactersp.SYA2乳糖酶活性在40℃以下時(shí)隨溫度的升高而上升，高于45℃之后酶活開始下降，表明其最適作用溫度范圍為40℃～45℃，其最適作用溫度較低，在60℃時(shí)酶活很低，只有最適酶活的26.97%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該酶最適作用溫度與乳酸克魯維酵母和脆壁克魯維酵母乳糖酶的最適作用溫度相近[1，14]。主要是由于高溫使酶蛋白分子中的氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵的斷裂，從而破壞了酶蛋白的天然構(gòu)像降低酶活性。

圖2 Enterobacter sp.SYA2乳糖酶最適作用溫度Fig.2 Optimum temperature of Enterobacter sp.SYA2 lactase

2.3 熱穩(wěn)定性

一般來說，溫度越低酶穩(wěn)定性越好，溫度越高其熱失活越快。所以在酶蛋白大都需要貯存在較低的溫度條件下。

圖3 Enterobacter sp.SYA2乳糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermostability of Enterobacter sp.SYA2 lactase

由圖3可知，Enterobactersp.SYA2乳糖酶在不同溫度保溫10min～60min，酶活基本呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。40℃保溫60min酶活低于對(duì)照酶活，45℃保溫40min酶活低于對(duì)照酶活，而50℃保溫30min酶活低于對(duì)照酶活。據(jù)報(bào)道，Kluyveromyces marxianusSK 16.001在20℃～45℃的范圍內(nèi)保溫30min，酶比較穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于50℃，酶活損失嚴(yán)重[15]。說明Enterobactersp.SYA2乳糖酶與Kluyveromyces marxianusSK 16.001乳糖酶一致，均屬于中溫乳糖酶。

2.4 最適作用pH值

pH值是影響酶活性的主要因素之一，酶蛋白分子中具有許多極性基團(tuán)，在不同pH值的溶液中，只有酶蛋白處于解離狀態(tài)時(shí)，酶才能與底物結(jié)合，發(fā)揮其催化作用。最適pH值的微小偏離，由于使酶活性部位的基團(tuán)離子化發(fā)生變化，而降低酶的活性。pH值發(fā)生較大偏離時(shí)，維護(hù)酶三維結(jié)構(gòu)的許多共價(jià)鍵受到干擾，導(dǎo)致酶蛋白自身變性。底物pH值對(duì)乳糖酶的活性有重要影響，在一定的pH值范圍內(nèi)，酶表現(xiàn)出較高的活性，pH值過高或過低都會(huì)影響酶的構(gòu)象，從而影響酶與底物的結(jié)合能力[16]。

圖4 Enterobacter sp.SYA2乳糖酶最適作用pH值Fig.4 Optimum pH o of Enterobacter sp.SYA2 lactase

由圖4可以看出，Enterobactersp.SYA2乳糖酶的最適作用pH值為6.5，酶活在pH6.0～8.5范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的酶活性，pH值超過8.5酶活降低，主要原因是由于酸堿的變化影響酶蛋白活性中心氨基酸殘基的解離情況所引起的。文獻(xiàn)報(bào)道，黑曲霉乳糖酶的最適作用pH值為4.0，作用pH值范圍為2.5～6.5，而芽孢桿菌EW-220的最適反應(yīng)pH值與本研究一致為6.5[17-18]，說明真菌乳糖酶的pH值作用范圍偏酸性，而細(xì)菌乳糖酶的pH值作用范圍近中性。

2.5 pH值穩(wěn)定性

圖5 Enterobacter sp.SYA2乳糖酶pH穩(wěn)定性Fig.5 p H stability of Enterobacter sp.SYA2 lactase

由圖5可以看出，Enterobactersp.SYA2乳糖酶在37℃時(shí)pH值為4.0～5.5時(shí)酶活較低，在6.0～8.5時(shí)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和酶活力，當(dāng)pH值大于8.5時(shí)酶活有下降趨勢(shì)。與不同最適作用pH值范圍相似，不同菌株乳糖酶的最適pH值穩(wěn)定性不同。黑曲霉乳糖酶在pH值2.5～7.0范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，而芽孢桿菌EW-220乳糖酶在55℃時(shí)pH值的穩(wěn)定范圍為5.5～8.0[17-18]。

2.6 金屬離子對(duì)酶活的影響

金屬離子對(duì)酶活的影響主要有激活作用和抑制作用2種類型。一般而言，金屬離子與酶蛋白結(jié)合后可以作為輔酶，起到激活作用；相反，受化學(xué)物質(zhì)的影響，酶的必須基團(tuán)或活性部位的生物化學(xué)特性改變，從而導(dǎo)致酶活力的降低或喪失就會(huì)引起抑制作用。

圖6 不同金屬離子對(duì)Enterobacter sp.SYA2乳糖酶酶活影響Fig.6 Effects of metal ions on the activity of Enterobacter sp.SYA2 lactase

不同金屬離子對(duì)Enterobactersp.SYA2乳糖酶活的影響見圖6，Mg2+、Mn2+對(duì)酶活有明顯的激活作用；Na+在高濃度條件下對(duì)酶活有一定的激活作用，在低濃度條件下對(duì)酶活影響不顯著；Zn2+、Cu2+、Fe2+對(duì)酶活有抑制作用；K+、Ca2+對(duì)酶活作用不顯著。據(jù)報(bào)道，不同金屬離子對(duì)不同菌株乳糖酶的作用不同，其中，Mg2+、Mn2+、K+是常見的酶激活劑[19-20]。

2.7 乳清水解實(shí)驗(yàn)

Enterobactersp.SYA2乳糖酶在35℃～45℃范圍內(nèi)酶熱穩(wěn)定性較好，最適溫度為40℃，所以選擇40℃保溫水解乳清。乳清中初始乳糖含量為4.55g/100mL，乳糖水解率隨水解時(shí)間的變化趨勢(shì)見圖7。

圖7 乳清中乳糖水解曲線Fig.7 Hydrolysis of lactose in whey

由圖7可看出，Enterobactersp.SYA2乳糖酶在40℃水解條件下水解乳清中乳糖，隨著水解時(shí)間的延長，水解率幾乎呈直線上升趨勢(shì)。當(dāng)酶添加量為1Um/L，3h的水解率可以達(dá)到50%，水解率到63%趨于平緩；酶添加量為2Um/L，1.5h水解率就可達(dá)50%，水解率到85%趨于平緩。在中性pH值范圍內(nèi)，該菌產(chǎn)生的乳糖酶不僅對(duì)底物ONPG有較高的水解能力，對(duì)乳糖的分解能力也較強(qiáng)，因此，可以將該酶應(yīng)用到乳品工業(yè)中，對(duì)廢棄物乳清進(jìn)行處理加工。

3 結(jié)論

（1）經(jīng)硫酸銨鹽析分級(jí)沉淀試驗(yàn)，選取硫酸銨的飽和度30%～85%為分級(jí)沉淀操作條件，分級(jí)沉淀后測(cè)得Enterobactersp.SYA2乳糖酶的相對(duì)酶活為45.85 U/mg。

（2）Enterobactersp.SYA2乳糖酶的最適作用溫度范圍為40℃～45℃，該酶在35℃時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，在40℃處理時(shí)酶活損失不大，在45℃和50℃處理時(shí)酶活損失較大，說明該酶為中溫乳糖酶。

（3）Enterobactersp.SYA2乳糖酶最適作用pH值為6.5，在pH 6.0～8.5范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，說明該酶為中性乳糖酶。

（4）通過研究金屬離子對(duì)Enterobactersp.SYA2乳糖酶的影響，可以得出Mg2+、Mn2+對(duì)酶活有明顯的激活作用；Na+在高濃度條件下對(duì)酶活有一定的激活作用，在低濃度下對(duì)酶活影響不顯著；Zn2+、Cu2+、Fe2+對(duì)酶活有抑制作用；K+、Ca2+對(duì)酶活作用不顯著。

（5）Enterobactersp.SYA2乳糖酶在40℃水解條件下水解乳清中乳糖，當(dāng)酶添加量為1Um/L，3h的水解率可以達(dá)到50%，水解率到63%趨于平緩；酶添加量為2Um/L，1.5h水解率就可達(dá)50%，到85%趨于平緩。

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