豬皮明膠肽體內(nèi)抗氧化功效的研究

張 閩，董文賓, *，張小強(qiáng)，蔡 理

（1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021；3.空軍工程大學(xué) 理學(xué)院，陜西 西安 710051）

1902年，倫敦大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Bayliss和Starling[1]第一次從狗的胃腸中分離到一種能引起胰腺分泌的活性多肽物質(zhì)（促胰液素Secretin）以后，各國研究人員根據(jù)本國居民的膳食結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)來源對活性肽進(jìn)行了廣泛的研究。目前，活性肽以其優(yōu)于氨基酸的吸收方式及無可比擬的生理調(diào)節(jié)功能，已成為天然藥物篩選和功能食品開發(fā)等領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。因此，研究和開發(fā)肽類產(chǎn)品是20世紀(jì)以來生物技術(shù)領(lǐng)域中，人們極為關(guān)注且發(fā)展較為活躍的領(lǐng)域之一。

自由基氧化生物大分子變性引起機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能受損，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生某些腫瘤、心腦血管疾病，引起疲勞、衰老，這些都已引起人們的強(qiáng)烈重視?？寡趸瘎┑南M(fèi)量越來越大，生產(chǎn)量最大的化學(xué)抗氧化劑的毒副作用被逐步認(rèn)識而受到限制，一些天然抗氧化劑也因?yàn)樵?、價(jià)格、顏色等各種因素制約而發(fā)展有限[2]。因此低價(jià)、高效、低毒的天然食品抗氧化劑的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。選用利用率或生物學(xué)效價(jià)不高的廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品及食品工業(yè)廢水、廢物為原料（如大豆粕、玉米黃粉、大米渣、魚皮、魚骨等）制備寡肽已成為當(dāng)今工業(yè)一個(gè)熱點(diǎn)[3-5]。各種原料生產(chǎn)的抗氧化肽以其分子量小、易吸收、活性強(qiáng)等特點(diǎn)受到重視，并能有效地清除體內(nèi)過剩的活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，在醫(yī)藥、化妝品、保健品、食品與飼料添加劑等方面有廣闊的應(yīng)用前景。因而篩選具有強(qiáng)抗氧化活性的天然資源已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的新趨勢。我國是地大物博的國家，特別是在農(nóng)產(chǎn)品資源方面，因此開發(fā)利用各種農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)高效的抗氧化劑具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級明膠（山東淄博杰樂寶恩生物科技有限公司饋贈），木瓜蛋白酶（Wolsen），KM封閉群無菌型小白鼠，雌雄各半（西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），微量丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（德國Heraeus公司），MinimateTFFsystem型超濾機(jī)（英國PALL公司），PHS-3C型臺式pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器（上海浦東物理光學(xué)儀器廠），722N紫外可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），其他為常規(guī)儀器。

1.3 方法

1.3.1 明膠肽的制備

參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]結(jié)合前期研究工作，用緩沖液在80℃溶脹明膠，木瓜蛋白酶水解明膠。酶解工藝條件：pH 6.2，酶含量4%，原料的質(zhì)量濃度4%，水解溫度51℃，時(shí)間5h。水解中用攪拌器3000r/min攪拌輔助酶解，水解完成后100℃加熱25 min滅酶，水解液用高速冷凍離心機(jī)離心、過濾，澄清后超濾機(jī)篩選分子量低于5000u的上清液備用。

1.3.2 小白鼠分組飼養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練

按照體重進(jìn)行隨機(jī)分組，共分成4個(gè)組，一個(gè)對照組和3個(gè)試驗(yàn)組。且每組要多養(yǎng)2～3只預(yù)防灌胃或者運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)溺水發(fā)生意外。日常自由采食飲水，灌胃飼養(yǎng)35d，灌胃時(shí)間安排在運(yùn)動(dòng)前2h，對照組灌胃雙重蒸餾水，試驗(yàn)組給予水解明膠肽，飼養(yǎng)量為動(dòng)物體重的3%。每天游泳訓(xùn)練一次，每次20min，水溫（30±2）℃，不負(fù)重。

1.3.3 血清及組織勻漿的制備

血清的制備：運(yùn)動(dòng)后休息30min，用暖風(fēng)機(jī)烘干小鼠，取血試管預(yù)先加入肝素抗凝劑（12500單位稀釋30倍），并低溫烘干。頸動(dòng)脈無麻醉狀態(tài)下取血，搖勻，即刻再放回冰浴中冷卻，3000r/min離心10min，分離血清，然后將血清傾入另一潔凈試管低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

組織勻漿的制備：組織采樣在采血后進(jìn)行，將小鼠放在粗糙的平面上，左手向下按壓頸椎，右手拉住小鼠尾部向后上方拉使頸椎脫臼處死小鼠（考慮化學(xué)麻醉導(dǎo)致組織留存較多血液，同時(shí)檢測指標(biāo)受化學(xué)試劑干擾影響測試結(jié)果，避免化學(xué)麻醉處死），在冰面上解剖后剝離取前（后）肢、肺和肝臟，經(jīng)冰凍生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，加5%三氯乙酸沉淀蛋白，取適量濕組織加生理鹽水按W:V=1:10在冰浴條件下用組織勻漿機(jī)制成勻漿（組織勻漿選小刀）。肺組織和肝臟控制轉(zhuǎn)速3000r/min，時(shí)間為10min；肌肉控制轉(zhuǎn)速為4000r/min，時(shí)間為15min，將上清液傾入另一潔凈試管低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 指標(biāo)測定

按照試劑盒指定的方法測定微量丙二醛（MDA）含量、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力、總抗氧化能力（T-AOC）和過氧化氫酶（CAT）活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠肽對小鼠體重的影響

小鼠購買后隨機(jī)分組。對照組平均23.37g，方差0.91；實(shí)驗(yàn)1#組平均24.15g，方差0.93；2#組平均24.2g，方差0.86；3#組平均24.1g，方差0.89。灌胃飼養(yǎng)35d后，對照組平均30.8g，方差1.37；實(shí)驗(yàn)1#組平均31.2g，方差1.41；2#組平均31.5g，方差1.56；3#組平均31.3g，方差1.27。試驗(yàn)組小鼠體重和對照組比較無明顯差異（p<0.05），說明明膠肽對小鼠體重?zé)o顯著影響。

2.2 明膠肽體內(nèi)抗氧化功效的測定結(jié)果與分析

表1 明膠肽對小鼠血液抗氧化酶活性和MDA 生成量的影響(n=10)Table 1 Effects of gelatin peptide on antioxidant enzyme activity and MDA production of mice's blood (n=10)

表2 明膠肽對小鼠不同組織抗氧化酶活性和MDA 生成量的影響(n=10)Table 2 Effects of gelatin peptide on antioxidant enzyme activity and MDA production of mice's organs (n=10)

生物體內(nèi)存在消除自由基的防御系統(tǒng)，即由一些酶和非酶物質(zhì)組成的抗氧化劑。包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）。SOD使超氧自由基被氧化成O2及同時(shí)還原成為H2O2；CAT可使過氧化氫分解成為水和氧氣；GSH-PX可使還原型的谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷墓入赘孰?，從而消除?xì)胞中的有機(jī)或無機(jī)的過氧化物。非酶抗氧化劑有維生素E、維生素C、胡蘿卜素、谷胱甘肽等，其可防止自由基的生成。這些抗氧化劑在體內(nèi)構(gòu)成一個(gè)完整的系統(tǒng)，分別對從氧化過程的開始到最后生成過氧化氫的自由基這一連鎖反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)起作用，使體內(nèi)自由基形成和消除處于一種動(dòng)態(tài)平衡中。

盡管機(jī)體內(nèi)有著各種抗氧化劑和抗氧化酶，但隨著年齡的增長，體內(nèi)抗氧化酶的活性逐步降低而氧自由基卻有增無減，從而導(dǎo)致生理系統(tǒng)功能衰退，并誘發(fā)多種癌癥及老年病。最近，國內(nèi)外內(nèi)許多研究表明，膠原水解所得到的膠原肽不但具有很好的消化特性，還有保護(hù)胃黏膜、抗?jié)?、抗氧化、抗過敏、抗衰老、降血壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)和生長、促進(jìn)皮膚膠原代謝、免疫調(diào)節(jié)等許多獨(dú)特的生理活性，已引起研究人員的廣泛興趣，膠原肽的很多活性都與其抗氧化性有關(guān)。從表1、表2可以看出，血清、肌肉、肺和肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）活力與正常對照組比較均增大，總抗氧化能力（T-AOC）也顯示出一致的變化，體內(nèi)各種抗氧化酶類在體內(nèi)起到抑制自由基產(chǎn)生的作用。MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可直接反映機(jī)體的過氧化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MDA生成量實(shí)驗(yàn)組明顯比對照組低，以上數(shù)據(jù)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。表明明膠肽有著良好的體內(nèi)活性，利用明膠肽灌胃小鼠具有提高生物抗氧化能力的功效，從而對機(jī)體起到保護(hù)作用。

依據(jù)已有的研究[10-12]，推測明膠肽發(fā)揮抗氧化活性與其氨基酸組成和肽分子構(gòu)象有關(guān)。有許多抗氧化氨基酸在活性肽抗氧化過程中起到了重要作用，如亮氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸。脯氨酸或羥脯氨酸側(cè)鏈和α-碳能夠被自由基氧化，從而保護(hù)其他物質(zhì)。而明膠肽中脯氨酸和羥脯氨酸含量在各種氨基酸含量中最高，推測明膠肽的這種氨基酸組成是其具有抗氧化作用的重要原因，此外，許多肽比構(gòu)成其的氨基酸抗氧化性要強(qiáng)，所以保持一定的肽鏈構(gòu)象同樣對活性肽的抗氧化活性有著很重要的作用。其作用機(jī)理還可能與其易吸收特性、高相融有關(guān)。

3 結(jié)論

大量的研究顯示[13-14]，生物體各器官均會產(chǎn)生不同程度的自由基，而同時(shí)也存在消除自由基的防御系統(tǒng)。正常情況下，自由基與自由基防御系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡中，一旦平衡被打破，自由基造成對機(jī)體的毒性作用。就會產(chǎn)生各種疾病，特別是一些慢性病如腫瘤、糖尿病、高血壓等，從而影響人體的健康。豬皮明膠酶解物可以有效地降低小鼠血清、肝組織、肺組織和肌肉組織中MDA的含量，提高小鼠血清、肝組織、肺和肌肉組織中的T-SOD、GSH-PX、CAT的活力和T-AOC。各項(xiàng)指標(biāo)與對照組相比有極顯著差異，可以說明豬皮明膠肽具有一定的抗氧化性。

豬皮是豬肉生產(chǎn)過程中的一種副產(chǎn)品，在肉制品廠的豬肉加工過程中，豬皮經(jīng)過熱處理后不能用于皮革制作，而在生肉的零售過程中，剔掉的碎豬皮亦無法用于皮革制作，除了部分食用外，其他的應(yīng)用較少。豬皮的主要成分為蛋白質(zhì)、脂肪、水，還有少量的纖維素和礦物質(zhì)。豬皮蛋白質(zhì)主要是膠原，膠原由于特殊復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，其分子量高達(dá)300ku，很難被機(jī)體消化吸收，通過蛋白酶水解可以將豬皮中的蛋白質(zhì)水解為肽，其反應(yīng)溫和，產(chǎn)品安全，適用于功能食品、化妝品及其他健康相關(guān)產(chǎn)品。本文主要以正常小鼠作對照，用自己制備的明膠肽喂養(yǎng)小鼠，各組自由飲水，自由攝食，飼喂35d后，禁食，頸動(dòng)脈采血，并解剖取肝、肺和肌肉組織測定微量丙二醛（MDA）含量，總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）活性和總抗氧化能力（T-AOC）來研究明膠肽的體內(nèi)抗氧化作用，以期為開發(fā)新的活性肽藥物和活性成分提供理論依據(jù)。

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