腦損傷細胞供體的研究現(xiàn)狀

周虎傳 張玉波 田洪 宋川 劉磊

腦損傷所引起的神經(jīng)功能損傷嚴重影響患者的生活質(zhì)量，并給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，因此尋找損傷后神經(jīng)功能修復(fù)的方法已成為目前研究的熱點，而細胞移植是修復(fù)神經(jīng)損傷的方法之一。而參與移植的細胞種類繁多，為了尋找一種更好、更合適的移植細胞，本文就目前出現(xiàn)的各種移植細胞做一綜述。

1 神經(jīng)干細胞

神經(jīng)干細胞(NSC)是神經(jīng)系統(tǒng)中終生保持增殖和分化潛能的細胞，處于分化的終末狀態(tài)，可通過對稱或不對稱分裂，生成新的干細胞和分化潛能逐漸降低的子細胞，最終生成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細胞，即神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞。NSC主要存在于胚胎時期的腦室和腦室下區(qū)的組織中，也存在于成人的臨近腦室室管膜下區(qū)、側(cè)腦室的室管膜、海馬齒狀回的顆粒細胞下層、脊髓中央管膜［1］。神經(jīng)細胞損傷后，體內(nèi)的室管膜神經(jīng)干細胞被激活并增殖、遷移到損傷部位，損傷后1個月內(nèi)可新增200萬個細胞，然而這些新增細胞大部分是膠質(zhì)細胞，主要促進損傷部位膠質(zhì)瘢痕形成，在促進神經(jīng)功能恢復(fù)是有限的，因此僅依靠內(nèi)源性的神經(jīng)再生不能達到完全修復(fù)神經(jīng)細胞損傷的目的。因此將異體NSC移植入腦損傷患者體內(nèi)促進腦損傷患者功能恢復(fù)成為必要。NSC是未分化的原始細胞，不表達成熟的細胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識別，可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長期存活。神經(jīng)干細胞在體外也能有效增殖［2］。因此異體神經(jīng)干細胞作為腦細胞移植細胞是可行的。許多研究表明，NSC移植物在宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)具有明顯的生存、遷移和分化能力，由人胎腦分離的NSC在植入胚胎或新生鼠腦內(nèi)后，表現(xiàn)為在宿主腦內(nèi)遷移并進行區(qū)域特異性分化，若將人胎腦NSC植入成年大鼠室管膜下區(qū)，它們沿吻側(cè)遷移流遷移入嗅球，分化為雙極神經(jīng)元，其分化命運與存留于室管膜下區(qū)的內(nèi)源性NSC相同。從成年哺乳動物CNS分離的NSC也具有較強的分化潛能，而決定NSC分化命運的主要因素除局部微環(huán)境外，還包括NSC的內(nèi)在特性。如成年動物脊髓NSC植入海馬齒狀回，能分化為神經(jīng)元;若植入成年大鼠脊髓則不分化為神經(jīng)元。將從成年動物海馬齒狀回獲得的NSC植入成年大鼠室管膜下區(qū)或遷移流后，能分化為嗅球神經(jīng)元;若植入成年大鼠海馬，則產(chǎn)生新的海馬神經(jīng)元［3］。無論胚胎或成人NSC，在移植入成人CNS非神經(jīng)發(fā)生區(qū)后大部分都分化成神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

目前NSC的應(yīng)用還存在不少問題:如建立的NSC系絕大多數(shù)來源于鼠，而鼠與人之間存在明顯的種屬差異;神經(jīng)干細胞的來源不足;部分移植的NSC發(fā)展成腦瘤;NSC轉(zhuǎn)染范圍的非選擇性表達及轉(zhuǎn)染基因表達的原位調(diào)節(jié);利用胚胎干細胞代替神經(jīng)干細胞存在著社會學(xué)及倫理學(xué)方面的問題等。NSC的來源、分離、培養(yǎng)及鑒定還有許多工作要做，神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)、分化及遷移機制有待進一步研究。通過細胞培養(yǎng)技術(shù)及基因組的研究，如DNA微列陣技術(shù)，進一步明確成體神經(jīng)干細胞的確切位置，可以設(shè)計藥物特異性地激活這些細胞。進一步認識NSC的本質(zhì)和控制分化基因，通過調(diào)控靶基因，可以從NSC誘導(dǎo)產(chǎn)生特定的分化細胞來滿足各種需要。橫向分化的發(fā)現(xiàn)對NSC的研究和應(yīng)用具有重要意義，人們有望從自體中分離誘導(dǎo)出神經(jīng)干細胞，有可能解決NSC的來源問題，NSC的應(yīng)用將有廣闊的前景。

2 間質(zhì)干細胞

間質(zhì)干細胞是中胚葉來源細胞，已經(jīng)從骨髓、脂肪組織、臍帶血、胎盤、胰腺分離出來。間質(zhì)干細胞具有強大的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，能有效抑制T細胞、B細胞、NK細胞的增生和功能，從而減少了免疫排斥反應(yīng)，增加間質(zhì)干細胞受體的耐受。一旦間質(zhì)干細胞能從捐獻者身上分離、擴增并冷藏保存，這種免疫抑制特點使間質(zhì)干細胞成為異體細胞移植的一個重要選者類型。有研究報道骨髓來源的間質(zhì)干細胞能產(chǎn)生神經(jīng)元細胞和許多組織特異細胞表型。有研究報道證實向新生鼠大腦側(cè)腦室移植入間質(zhì)干細胞，間質(zhì)干細胞可移行并分化為嗅球顆粒細胞和室周星形細胞［4］;有研究報道證實移植入大鼠體內(nèi)的間質(zhì)干細胞可移行到損傷的腦組織并存活下來，有部分植入的間質(zhì)干細胞表達神經(jīng)元和星形細胞的標志，間質(zhì)干細胞治療顯著提高了腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù);研究證實在大鼠大腦損傷后6 h內(nèi)盡早向鞘內(nèi)注入1百萬個間質(zhì)干細胞，注入的間質(zhì)干細胞可提供神經(jīng)保護;在腦外傷、中風(fēng)后24 h內(nèi)或1周內(nèi)注入間質(zhì)干細胞2～8百萬個也顯著提高神經(jīng)功能恢復(fù)結(jié)果;在卒中后1個月注入間質(zhì)干細胞3百萬個證實具有治療學(xué)意義。間質(zhì)干細胞表達趨化因子受體4(CXCR4)、SDF1與趨化因子4(CXCR4)相互作用，可能促使植入的間質(zhì)干細胞移向損傷腦組織［5］。間質(zhì)干細胞分泌各種各樣的生長因子包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維生長因子(FGF)，因而可擴大內(nèi)生腦組織水平。間質(zhì)干細胞也能誘導(dǎo)內(nèi)源性實質(zhì)細胞產(chǎn)生這些生長因子，這些營養(yǎng)因子能增強腦損傷邊緣區(qū)的血管再生和血管穩(wěn)定，而腦損傷邊緣區(qū)是在腦內(nèi)存活下來的大多數(shù)間質(zhì)干細胞定植的地方。間質(zhì)干細胞能增加VEGF的表達促進卒中后血管再生，這些生長因子也能促進神經(jīng)再生。間質(zhì)干細胞不僅能增加腦損傷后邊緣帶和海馬的血管密度，而且能增加大鼠腦損傷后的海馬亞粒狀區(qū)和側(cè)腦室下區(qū)的神經(jīng)再生。另外，間質(zhì)干細胞可誘導(dǎo)損傷腦組織星形細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP4、連接蛋白的表達，并能促進突觸發(fā)生，在卒中大鼠，間質(zhì)干細胞不僅與增強血管再生、神經(jīng)再生、突觸發(fā)生一致，間質(zhì)干細胞能顯著減少膠質(zhì)瘢痕形成并能促進神經(jīng)膠質(zhì)軸突重塑［6］，因此間質(zhì)干細胞發(fā)揮的治療作用可能不僅歸因于少量的分化為腦細胞的間質(zhì)干細胞，然而間質(zhì)干細胞似乎作為營養(yǎng)因子的產(chǎn)生細胞通過血管再生、神經(jīng)再生、突觸再生和軸突重塑促進了腦功能恢復(fù)。如果腦損傷大鼠延遲治療，僅靠間質(zhì)干細胞的單獨作用，不能減少腦外傷后的腦損傷體積，而隨間質(zhì)干細胞一起植入的膠原支架確能減少腦損傷體積，促進間質(zhì)干細胞移行入損傷邊緣帶，并且改善立體空間學(xué)習(xí)和感覺運動功能［7］。

3 臍帶血來源的干細胞

臍帶血來源細胞因為具有易于收集、較大的可用性、相對較低的免疫原性可以減少排斥反應(yīng)、可以靜脈注射植入等特點，因此可能成為細胞移植的備選細胞。臍帶血來源干細胞能分化為造血干細胞和非造血干細胞，臍帶血來源干細胞由未成熟的淋巴細胞和單核細胞組成，大約有1%的單核細胞是CD+34細胞，CD34是造血干細胞和內(nèi)皮祖細胞的標志物［8］。臍帶血來源干細胞的不成熟性增加了其轉(zhuǎn)分化為其他細胞類型用于自體和異體移植的可能性。另外，臍帶血來源干細胞產(chǎn)生間充質(zhì)細胞，間充質(zhì)細胞在體外能大量增殖，因不能分化為脂細胞，所以分化譜系有限。內(nèi)皮祖細胞能分泌血管生長因子和促進神經(jīng)再生，已經(jīng)從臍帶血來源CD+34細胞分離出來，在體外可促進胚胎干細胞生長。臍帶血細胞被建議用于神經(jīng)性障礙的治療，因為臍帶血細胞能分化為膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元樣細胞［9］。

4 造血干細胞

造血干細胞存在于循環(huán)末梢血和骨髓中。它們分化為其他細胞類型的潛能還沒有被證實，但是研究表明造血干細胞自體移植能調(diào)節(jié)因自體免疫復(fù)合物導(dǎo)致的神經(jīng)變性疾病的早期免疫應(yīng)答［10］。

5 脂肪來源基質(zhì)細胞衍生干細胞

ADSCs是間充質(zhì)細胞的一個備選來源，能分化為脂肪細胞、骨細胞、肌肉。這些多能干細胞易于培養(yǎng)擴增，適用于自體干細胞移植。然而幾乎沒有研究證實這些細胞可以分化非中胚層組織細胞系，如神經(jīng)元。而且也沒有顯示出這些細胞在神經(jīng)變性疾病動物模型上有治療意義［11］。

6 子宮內(nèi)膜再生細胞

子宮內(nèi)膜再生細胞是間充質(zhì)樣細胞，能分化各種中胚層、外胚層和內(nèi)胚層組織。子宮內(nèi)膜再生細胞不表達間充質(zhì)細胞標志物STRO-1，但是可以表達非造血干細胞表型和胚胎干細胞標志物oct-4細胞擴增證實子宮內(nèi)膜再生細胞沒有至腫瘤性、沒有致畸染色體核型和功能。初步研究證實子宮內(nèi)膜再生細胞具有免疫調(diào)節(jié)特性，這對異體移植是需要的。子宮內(nèi)膜再生細胞是一種引人注目的新的干細胞備選細胞;因為可以無創(chuàng)的從月經(jīng)血里收集這種細胞，并且具有強大的增生能力，已經(jīng)證實對四肢缺血和壞死模型具有治療效果［12］。

7 胚胎干細胞

胚胎干細胞(ESCs，簡稱ES或EK細胞)是早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細胞都能被誘導(dǎo)分化為機體幾乎所有的細胞類型。研究者在1995年從獼猴分離出第一個胚胎干細胞，幾年后又從絨猴和人類分離出胚胎干細胞［13］。人體胚胎干細胞系的開發(fā)代表胚胎干細胞為發(fā)育生物學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)、移植、再生醫(yī)學(xué)的研究提供了無限的細胞來源。但是在它們的潛能被利用之前，需要做更多的鑒定和評估來克服它們在應(yīng)用中的遺傳問題:如缺乏遺傳穩(wěn)定性，致畸胎瘤的風(fēng)險、缺乏長期生存的能力。

8 來源于孤雌生殖、體細胞核移植和改變的體細胞核移植的ES樣細胞

因為用胚胎干細胞進行研究有許多限制因素，所以研究者找到了一種與ES具有相似特點的細胞，主要通過孤雌生殖、體細胞核轉(zhuǎn)移和改變的體細胞核轉(zhuǎn)移獲得這種細胞，這種方法避開了為了獲得ES而致胚芽死亡的倫理問題。孤雌生殖是一種無性繁殖，胚芽的形成不需要雄性受精;缺乏雄性的DNA意味著孤雌生殖不會充分發(fā)育，但是能提供囊胚，產(chǎn)生能分化為各種需要的細胞類型的ES。哺乳類動物卵母細胞在體外激活后其孤雌激活胚可以發(fā)育到囊胚期，在鼠和非人靈長類如猴子中已建立了孤雌胚胎干細胞系，具有ES相似的多潛能性。人類卵母細胞可在體外激活后成功獲得孤雌激活胚，并在體外培養(yǎng)可發(fā)育至囊胚。研究發(fā)現(xiàn)孤雌ES系經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)，可以分化成多巴胺能神經(jīng)元細胞、自發(fā)跳動的心機樣細胞、脂肪細胞、上皮細胞。在患有嚴重免疫缺陷病的小鼠腹腔培養(yǎng)，該細胞系發(fā)育成完全分化的軟骨組織、肌肉和骨骼、神經(jīng)元、黑素細胞、皮膚和毛囊、腸道和呼吸道上皮組織。體細胞核移植又稱體細胞克隆，作為動物細胞工程技術(shù)的常用技術(shù)手段，即把體細胞核移入去核卵母細胞中，使其重組并能發(fā)育為新的胚胎。雖然至少有一項研究報道通過體細胞核移植成功獲得ES樣細胞，但是這種方法成功率很低，仍然存在倫理方面的問題，因為這種方法仍然會產(chǎn)生一個能充分發(fā)育并且能植入的胚芽。改變的體細胞核移植是一種更容易被接受的克隆變體。在體細胞核移入去核卵母細胞之前，體細胞核內(nèi)用于胚胎形成必不可少的基因被徹底改變了，從而不能發(fā)育成胚胎，但是能獲得ES樣細胞［14］。

9 誘導(dǎo)性多能干細胞

誘導(dǎo)性多能干細胞來源于皮膚成纖維細胞，成纖維細胞通過一組組合基因的激活使其脫分化為多能干細胞。這種技術(shù)繞開了破壞胚芽、克隆技術(shù)、卵母細胞的利用率等存在倫理問題。研究者已經(jīng)成功的從齒嗤類、獼猴、人類獲得了誘導(dǎo)性多能干細胞，他們已經(jīng)從肌萎縮側(cè)索硬化、脊髓性肌萎縮、帕金森患者的成纖維細胞獲得誘導(dǎo)性多能干細胞。從患病供體獲得誘導(dǎo)性多能干細胞可能推進個體化用藥和體外疾病模型的發(fā)展。此外，誘導(dǎo)性多能干細胞移植可以讓受體與供體得到完美的免疫匹配，雖然這種移植的臨床可行性還需要解決與移植物存活、長期分化、遺傳穩(wěn)定性相關(guān)的主要問題。已有研究證實結(jié)合維甲酸誘導(dǎo)和無血清培養(yǎng)基篩選方法，可以高效率誘導(dǎo)人誘導(dǎo)性多能干細胞向神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)化［15］。

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