三葉因子3研究進(jìn)展

周 帥，符國(guó)珍

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院暨?？谑腥嗣襻t(yī)院肝膽外科，海南 ?？?570208)

三葉因子(Frefoil factor family，TFF)是一類含一個(gè)或兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白，該結(jié)構(gòu)域是由六個(gè)半胱氨酸的三對(duì)二硫鍵形成典型的三葉狀結(jié)構(gòu)，因此稱為三葉因子。而此特殊三葉狀結(jié)構(gòu)賦予了TFF家族蛋白耐酸、耐堿和耐蛋白酶水解的特性，同時(shí)也是其在胃腸道行使功能所必需的結(jié)構(gòu)。目前研究表明，人類TFF包括三類：乳腺癌相關(guān)的多肽(Spasmolytic peptide-2，PS2或Trefoil factor family-l，TFF1)、解痙多肽(Spasmolytic peptide，SP或trefoil factor family-2，TFF2)和小腸三葉因子(Intestinal trefoil factor，ITF或Trefoil factor family-3，TFF3)。 其 中 TFF3 于 1991 年 由Suemori首次在大鼠空腸發(fā)現(xiàn)[1]。TFF3在黏膜防御、修復(fù)、再生以及免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，并且其表達(dá)的異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

1 分子結(jié)構(gòu)和組織分布

自Suemori等[1]于1991年發(fā)現(xiàn)TFF3在小鼠空腸表達(dá)以來，Chinery等[2]和Schmitt等[3]在1996年相繼報(bào)道了編碼TFF3的基因和其他的三葉因子家族一樣位于染色體21q22.3。TFF3和TFF1一樣都只含有一個(gè)環(huán)狀構(gòu)成三葉狀結(jié)構(gòu)域，但在研究TFF3三級(jí)結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，其表面(第2、3個(gè)環(huán)之間)存在一個(gè)疏水的口袋狀的結(jié)構(gòu)[4]，而此結(jié)構(gòu)可能就是其與其他蛋白作用的結(jié)合位點(diǎn)。TFF3蛋白的等電點(diǎn)是4.75[5]。在體內(nèi)，TFF3以單聚體或者同源二聚體的形式與其他蛋白質(zhì)構(gòu)成化合物而發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TFF3二聚體的三葉狀結(jié)構(gòu)域的N端有一個(gè)螺旋狀結(jié)構(gòu)突出于核心基團(tuán)之外，并且其結(jié)構(gòu)并不像TFF1二聚體是由兩個(gè)疏松的單聚體構(gòu)成，而是由單聚體中的兩個(gè)二硫鍵相鏈接，構(gòu)成緊密的結(jié)構(gòu)[5]。但是有關(guān)TFF3二聚體生物與單聚體的活性，目前相關(guān)研究存在不同的結(jié)果[5-6]。

TFF3在生理狀態(tài)下，主要表達(dá)于消化道黏膜及其他黏膜中的杯狀細(xì)胞。Xian等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TFF3的表達(dá)水平隨著小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的增多而上升。Kouznetsova等[8]利用 rt-PCR、Western blot等對(duì)胃不同部位的黏膜表達(dá)TFF3經(jīng)行了分析，發(fā)現(xiàn)胃體的泌酸腺體黏膜表達(dá)很少的TFF3，但在胃體、胃竇移行區(qū)有大量TFF3的表達(dá)，在幽門區(qū)以及十二指腸近段有TFF3分泌。Madsen等[9]對(duì)體內(nèi)多種組織TFFS的表達(dá)情況研究發(fā)現(xiàn)，TFF主要分布于胃腸道，在生理情況下，TFF1主要分布于胃和結(jié)腸，TFF2主要分布在胃。TFF3主要分布在結(jié)腸，但在很多組織的黏膜表面都可檢測(cè)到。

2 生理功能及其作用機(jī)制

胃腸道黏膜屏障是維護(hù)人體健康的重要因素。腸黏膜屏障損傷的機(jī)制包括腸黏膜缺血、缺氧及氧自由基的損傷、細(xì)胞因子的損傷、腸道免疫功能受損和細(xì)胞凋亡。TFF3在胃腸黏膜機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障和免疫屏障等扮演著不同的角色。

2.1 黏膜修復(fù)和保護(hù)作用 腸黏膜屏障中的杯狀細(xì)胞分泌蛋白是腸黏膜的重要組成部分，也是腸道抵御疾病的重要物理屏障。Chen等[10]利用Western blot和免疫沉淀法分析了TFF3、IgGFcγBP和Muc2在腸黏膜疏松層和致密層黏液存在方式，發(fā)現(xiàn)這三種腸黏膜分泌的蛋白在腸黏膜中相互鏈接，在黏膜中構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，從而保護(hù)腸黏膜免受胃酸等有害因素的損害。

2.2 抑制黏膜細(xì)胞的凋亡 胃腸道黏膜上皮細(xì)胞是抵御有害因素的重要屏障，在免疫、炎癥、腫瘤的形成等病理生理過程中NF-κB起著抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而保護(hù)胃腸道黏膜免受外界有害因素的損害。Chen等[10]利用大鼠ICE-18細(xì)胞作為研究模型，利用NF-κB阻斷劑研究TFF3對(duì)小腸上皮細(xì)胞的效應(yīng)，研究結(jié)果表明：①TFF是胃腸道分泌的內(nèi)源性多肽；②在小腸上皮細(xì)胞中，TFF3能促進(jìn)NF-κB的活性，從而增強(qiáng)ICE-18細(xì)胞的抗凋亡能力；③TFF3對(duì)小腸上皮細(xì)胞的抗凋亡效應(yīng)是通過NF-κB相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)瀑布效應(yīng)來調(diào)節(jié)的。但是Loncar等[11]研究缺發(fā)現(xiàn)NF-κB和TNF均會(huì)導(dǎo)致小腸黏膜TFF3表達(dá)的降低，但這種效應(yīng)能被IκB(NF-κB抑制劑)所抑制。另有研究表明NF-κB轉(zhuǎn)錄因子亞單位的結(jié)合位點(diǎn)在TFF3的5’端區(qū)域[12]。但是具體的調(diào)節(jié)方式以及調(diào)控的相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。而PI3-K/Akt途徑促進(jìn)了TFF3和MUC2在小腸上皮細(xì)胞的表達(dá)，TFF3又能反過激活PI3-K/Akt途徑，以此來下調(diào)Caspase-3/9的活性，因此TFF3在小腸黏膜的杯狀細(xì)胞分化中亦扮演著重要的角色[13]。TFF3在抑制腸道黏膜凋亡、杯狀細(xì)胞的分化中扮演著不同的角色，從而對(duì)黏膜起到保護(hù)作用[10]。

2.3 免疫屏障 免疫屏障在胃腸道黏膜保護(hù)中也扮演著重要作用。Cook等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)，TFF3通過促進(jìn)單核細(xì)胞的遷移調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以此發(fā)揮對(duì)黏膜的修復(fù)和保護(hù)作用。Tan等[15]發(fā)現(xiàn)TFF3通過上調(diào)COX-2從而促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌PGE-2和PGI-2，從而避免氧化應(yīng)激對(duì)上皮細(xì)胞的損傷。從而分析認(rèn)為TFF3對(duì)上皮細(xì)胞具有保護(hù)和修復(fù)作用。

2.4 腫瘤的擴(kuò)散 除了研究其胃腸道黏膜保護(hù)作用，對(duì)于TFF3在腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和入侵方面也有一些研究。上皮細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方面的改變與其細(xì)胞間粘附的調(diào)節(jié)機(jī)制的關(guān)系比較密切，即E-cadherin/catenin細(xì)胞粘附復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TFF3的細(xì)胞表達(dá)E-cadherin、alpha和beta-catenin都明顯減少，而且E-cadherin表達(dá)的減少與轉(zhuǎn)錄時(shí)的甲基化沒有關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染hTFF3的細(xì)胞E-cadherin半衰期縮短，也就是E-cadherin加速了降解。因此TFF3在轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后修飾過程中對(duì)E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞之間的粘附調(diào)節(jié)在TFF3的致病以及腫瘤擴(kuò)散有重要的作用[16]。另一研究也證實(shí)了上述說法，TFF3對(duì)于黏膜的修復(fù)作用是通過下調(diào)E-cadherin、加強(qiáng)細(xì)胞間連接、促進(jìn)細(xì)胞遷徙來實(shí)現(xiàn)的；此外，TFF3亦可上調(diào)上皮細(xì)胞中tightening cIaudin-l的含量、下調(diào)tighteningclcIaudin-2的表達(dá)，增強(qiáng)表層細(xì)胞的抵抗力、降低上皮的滲透性來達(dá)到黏膜修復(fù)的目的[17]。

3 TFF3與疾病

3.1 TFF3與炎性疾病 目前，研究發(fā)現(xiàn)胃腸道炎性疾病,以及肝臟疾病、胰腺炎等的病變組織中,TFF出現(xiàn)異常表達(dá)現(xiàn)象。這種異常一般表現(xiàn)為異位表達(dá)和/或表達(dá)量增加，其作用與黏膜修復(fù)和再生有關(guān)。非甾體抗炎藥物所致的胃黏膜損傷會(huì)引起黏膜局部的微環(huán)境改變，比如上皮細(xì)胞的氧供給減少。Hernandez等[18]通過阿司匹林制造大鼠胃黏膜炎癥模型，繼而采用缺氧探針免疫染色、免疫組化、Western blot以及RT-PCR等方法檢測(cè)大鼠胃黏膜中TFF3的含量，發(fā)現(xiàn)給予阿司匹林的大鼠胃黏膜中TFF3水平是正常組的1.8倍，同時(shí)缺氧的胃黏膜TFF3 mRNA的含量是正常組的9.3倍。

3.2 TFF3與腫瘤 目前對(duì)TFF3的研究更多的集中在研究其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)性。Okada等[19]對(duì)小鼠肝癌模型和人的肝細(xì)胞癌組織中TFF3的表達(dá)情況研究，發(fā)現(xiàn)7只小鼠肝癌組織中有6只TFF3基因是高表達(dá)的，而在人肝癌組織中有40%的組織中TFF3在mRNA和蛋白水平都升高。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)TFF3啟動(dòng)子CpG-260的甲基化水平與TFF3的高表達(dá)相關(guān)，因此推測(cè)TFF3的表達(dá)是肝癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要過程，同時(shí)啟動(dòng)子的甲基化可能對(duì)TFF3的表達(dá)具有調(diào)控作用，從而抑制肝癌的發(fā)展。TFF3的異常表達(dá)在甲狀腺[20]、乳腺、胃、腸道22以及免疫系統(tǒng)[14]、中樞系統(tǒng)等[22]腫瘤組織和血中均有報(bào)道。但TFF3與腫瘤的具體相互作用目前報(bào)道還比較少，有待進(jìn)一步研究。

4 TFF3檢測(cè)與臨床實(shí)驗(yàn)診斷

TFF3是最近十年研究較為熱門的微量分泌蛋白，ELISA以及腫瘤分泌蛋白組學(xué)等都是TFF3臨床實(shí)驗(yàn)診斷常用的成熟技術(shù)。Vestergaard等[23]設(shè)計(jì)研發(fā)了TFF3的ELISA檢測(cè)方法，并進(jìn)行了初步的應(yīng)用嘗試。在正常人群血清中TFF3的濃度為91～250 pmol/L，并且其與年齡和性別無關(guān)，初步的應(yīng)用到胃腸道的相關(guān)疾病中，研究結(jié)果提示血清TFF3水平與臨床病理改變之間具有相關(guān)性并且對(duì)研究胃腸道相關(guān)疾病具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的價(jià)值。Xue等[24]應(yīng)用蛋白組學(xué)方法，通過對(duì)來自于同一病例的結(jié)腸直腸癌原發(fā)癌細(xì)胞株SW480和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株SW620的比較分析，篩選出TFF3、GDP15等6個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)志物。進(jìn)一步利用Western blot和大規(guī)模的血清樣本隊(duì)列分析，檢測(cè)結(jié)果顯示病例組的血清TFF3水平顯著高于正常對(duì)照組，淋巴轉(zhuǎn)移癌高于非淋巴轉(zhuǎn)移癌。而病例資料分析表明TFF3的高水平與腫瘤的較高組織學(xué)分級(jí)及TNM分期、轉(zhuǎn)移的進(jìn)展程度顯著相關(guān),而與性別、年齡、腫瘤部位無顯著相關(guān)性。其研究認(rèn)為血清TFF3和GDP15檢測(cè)可能成為結(jié)腸直腸癌鑒別，特別是癌轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)的有較高應(yīng)用價(jià)值的臨床診斷試驗(yàn)。

總之，TFF3是重要的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)因子，它的生理病理功能與組織再生修復(fù)、細(xì)胞遷移、增殖分化乃至腫瘤的發(fā)生發(fā)展等功能密切相關(guān)，這也使其可能作為炎癥發(fā)生的調(diào)節(jié)因子、抑癌基因或癌基因來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。不容置疑的是，大量研究成果所揭示出的其在病理研究中的表現(xiàn)與病理改變之間的相關(guān)性，引起了學(xué)者們對(duì)于TFF3是否可以成為一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)志物的研究興趣。對(duì)于TFF3是否能應(yīng)用于臨床診斷,還需要更多的、多中心的、特別是前瞻性的研究資料來加以判斷，這也是學(xué)者們共同強(qiáng)調(diào)的觀點(diǎn)。可以相信，隨著對(duì)TFF3生物學(xué)功能研究的不斷深入，特別是在腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)及療效觀測(cè)等方面的研究，TFF3在相關(guān)疾病的臨床診斷的潛在價(jià)值將會(huì)得到進(jìn)一步的挖掘和展現(xiàn)。

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