機械牽張刺激對成肌細胞成肌調控的研究進展

李菲菲，曲竹麗，王慶，郭杰

(1山東大學口腔醫(yī)院正畸科，山東 濟南 ；2山東省口腔生物醫(yī)學重點實驗室）

機械牽張刺激對成肌細胞成肌調控的研究進展

李菲菲1,2，曲竹麗1，王慶1，郭杰1,2

(1山東大學口腔醫(yī)院正畸科，山東 濟南 ；2山東省口腔生物醫(yī)學重點實驗室）

機械牽張；成肌細胞；調控

功能矯形治療是口腔正畸學中一種重要的矯治方法，通過功能矯治器引導下頜姿勢位前移。改善口頜系統(tǒng)肌群的功能狀態(tài)，利用肌收縮力刺激頜骨發(fā)生適應性生長改建，從而矯治錯頜畸形。研究表明，下頜前伸時，肌肉變化早于骨組織；牙頜畸形矯治后，面頜肌肉的改建尚未完成，只有肌肉的適應性改建完成后，并與硬組織協(xié)調平衡后，才能保持療效防止復發(fā)。因此，面頜肌肉在牙頜畸形的矯治和療效維持中均起著重要作用。

面頜部肌肉屬于骨骼肌，骨骼肌可塑性強，其結構和功能可隨外界刺激的改變發(fā)生適應性改建，參與這一過程的重要細胞學基礎是骨骼肌中的成肌細胞。力學刺激是維持細胞生存和生長的重要細胞外刺激，在骨骼肌的形成、發(fā)育和適應性改建中起著重要作用。成肌細胞是其重要的感受和效應細胞，通過力敏感的多種信號通路，將力學刺激信號轉化為細胞生物化學信號，介導力相關敏感基因表達，合成各種酶類等活性物質，激活信號網(wǎng)絡級聯(lián)反應，參與一系列復雜的生理病理活動[1-2]。體內力學環(huán)境復雜，多用離體實驗觀察細胞對力學刺激的反應。國內外有關機械牽張刺激對體外培養(yǎng)成肌細胞影響的研究，為生物力學研究提供了大量理論和實驗依據(jù)。

1 牽張應力特點與加載裝置的原理

牽張加力的加載裝置主要是通過各種方法對培養(yǎng)基膜產(chǎn)生牽拉，使得生長黏附于基膜上的成肌細胞被動伸展。常見裝置有四點彎曲、Flexercell、均勻雙軸等模型。應用此類裝置，能較好的模擬體內肌肉受牽拉的狀態(tài)，通過調節(jié)力學刺激的力值大小、時間、頻率來檢測細胞相應變化。

基底形變加載技術是目前應用較多的技術原理之一，它是通過機械外力的作用牽拉彈性基底膜，引起彈性細胞培養(yǎng)膜的形變，使附著于該培養(yǎng)膜的細胞受到牽張力。近期有新型離心牽拉裝置，利用離心力控制牽張力的大小。

2 成肌細胞的生物學特征

2.1 成肌細胞的來源與分布 成肌細胞是指胞漿中含有肌絲的肌組織前體細胞，包括心肌、平滑肌及骨骼肌在內的三種肌組織。其胚胎發(fā)育均經(jīng)歷了由間充質分化為成肌細胞，再進一步分化為成熟肌細胞的過程。成熟個體的心肌及平滑肌中均不含肌肉衛(wèi)星細胞，而骨骼肌中存在肌肉衛(wèi)星細胞。骨骼肌的肌纖維分為快肌纖維和慢肌纖維，分布不均一，隨著年齡增長，衛(wèi)星細胞密度減少，到一定程度后，終身維持[3]。

通常情況下，肌衛(wèi)星細胞處于靜止和轉錄不活躍狀態(tài)，當機體發(fā)生生長、重塑及肌肉損傷時，衛(wèi)星細胞被激活，增殖并表達成肌細胞標志物即成成肌細胞，這些細胞再融合入已存在的骨骼肌纖維中，形成新的纖維。

2.2 成肌調節(jié)因子 成肌調節(jié)因子是在骨骼肌胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的一組轉錄調控因子，其家族共有四個成員：MyoD、Myf25、Myogenin和MRF4。這些成肌調節(jié)因子共有一個與E2蛋白轉錄因子家族結合形成二聚體所需的DNA結合域Bhlh，MRF2E蛋白異二聚體和MRF單體結合到共有的E2盒序列CANNTG,而CANNTG存在于骨骼肌成肌特異基因的增強子元件中，調節(jié)著這些成肌分化特異基因的轉錄活性，這些二聚體的DNA結合和轉錄活性也受到蛋白間相互作用和其他外在環(huán)境因素的影響[4-5]。

MyoD和Myf25之間較另外兩大因子具有更大的同源性，在成肌細胞分化前表達，是成肌分化的決定因子。兩者的作用都是誘導前成肌細胞分化成成肌細胞。兩者可以相互替代，兩者的聯(lián)合缺少均會阻礙其分化。MyoD基因是骨骼肌分化的決定基因。在肌分化過程中，首先是成肌細胞的定向分化，以表達肌細胞生成素為標志，肌細胞生成素是成肌細胞特異標志之一。MyoD是肌分化的發(fā)動者，但并非直接激活下游基因，而是首先激活肌細胞生成素，接著再是肌球蛋白和結蛋白等的表達，它們都是骨骼肌最早的成肌標志之一。Myogenin和MRF4之間具有更大的同源性，并且均在分化中表達；作用都是誘導成肌細胞分化融合成肌管。Myogenin是成肌分化必不可少的因子。研究表明，增殖的成肌細胞在分化激活之前表達MyoD和Myf5，一旦分化被激活MyoD和Myf5則誘導細胞推出細胞周期，同時表達Myogenin，Myogenin和MRF4調節(jié)成肌細胞進一步終末分化為肌管肌纖維[6-7]。

2.3 肌細胞增強因子與肌肉的發(fā)生 肌細胞增強因子2（MEF2）屬于MADS框轉錄家族，其家族成員包括MEF2A,MEF2B,MEF2C,MEF2D四種。轉錄基因MEF2的DNA結合位點廣泛存在于肌肉組織特異性表達基因的調控區(qū)，因此MEF2在肌肉發(fā)生中發(fā)揮重要調控作用。MEF2可以激活多種肌肉發(fā)生特異基因的表達，這些基因的表達產(chǎn)物對于肌肉組織的分化、維持和再生等有重要作用。MEF2在肌肉發(fā)生的基因表達調控中位于很多信號傳導通路的下游，同時它又直接調控著它的下游靶基因的表達，從而實現(xiàn)調控肌肉生長發(fā)育的生物學功能，如：波形蛋白與Cofilin在細胞分化過程中的細胞骨架重組中至關重要[8]。因此是肌肉發(fā)生、肌肉改建的重要標志。

3 機械牽張與成肌細胞的成肌調控

3.1 應力與細胞生物學應答 天然機體處在一個復雜的力學環(huán)境中，其應力影響著組織的結構、功能及形態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，細胞都依賴于一定的力學環(huán)境的調節(jié)，即使同一類型的細胞，由于應力的大小、作用方式、作用時間及應力變化頻率的不同，其影響均不同。這種差異證明細胞的生物學變化與應力應變方式的不同有著密切聯(lián)系。無論何種應力都會使細胞發(fā)生形變，形變是應力作用于細胞并觸發(fā)其生物學效應的基礎，不同應力方式對細胞形變產(chǎn)生很大差別。在靜張應力下，細胞逐漸發(fā)生變形，但這種變形在一段時間后就會趨于穩(wěn)定，在細胞趨于穩(wěn)定的過程中，也會慢慢失去對靜張應力的敏感；在動張應力的作用下，細胞無持續(xù)的穩(wěn)定狀態(tài)出現(xiàn)。

3.2 機械牽張對成肌調控的影響 近年來，隨著骨骼肌再生、損傷后修復與適應性改建的研究受到廣泛關注,有關骨骼肌細胞的增殖、凋亡和分化在骨骼肌再生中的作用研究也逐漸興起。細胞外基質的一些信號參與調控成肌過程,其中力學應激是維持細胞生存和生長的重要細胞外刺激,它能夠調節(jié)細胞的新陳代謝和基因表達過程,在骨骼肌的形成和發(fā)育中起重要的作用[9]。

通過對力學刺激作用于肌衛(wèi)星細胞增殖分化的研究,證實了不同的力學刺激所激活的信號通路并不完全相同。正是通過這些特異性信號轉導通路的激活、封閉或者不同通路之間的cross－talk途徑,從而對成肌轉錄因子及骨骼肌標志性蛋白的表達進行調控,對肌衛(wèi)星細胞的增殖分化能力產(chǎn)生影響。

目前較多文獻報道看機械應力對體外培養(yǎng)的細胞增殖的影響，但因采用的力學加載裝置不同而結果不一，Kumar等利用Flexercell加載設備對C2C12細胞進行拉伸試驗，發(fā)現(xiàn)拉伸能夠促進C2C12細胞的增殖，而抑制其分化。在不同拉伸頻率下，成肌細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)拉伸頻率對細胞增殖的影響非常大，高頻率的拉伸不利于細胞的增勢，反而抑制成肌細胞的增殖，當拉伸頻率降低到0.125時，拉伸的力學刺激是明顯促進成肌細胞的增殖[8-9]。有研究研究不同交變應力的作用下，大鼠細胞增殖活性的變化，同樣是發(fā)現(xiàn)，低頻率比高頻率具有更高的促進成肌細胞增殖的作用。隨著交變應力作用時間的延長，成肌增殖活性在較低的應變范圍內隨應變的增大而增加。Zhang等[10]研究證實：周期性張應力通過激活其下游信號分子——黏附斑激酶(FAK)和RhoA，在調控成肌細胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。Comunale等[11]的研究表明M-cadherin介導的信號途徑參與了成肌細胞相互融合形成肌管的過程。Kumar等[12]卻發(fā)現(xiàn)周期性拉伸可通過FAK、Rac-1、GTPase以及NF-B等信號分子抑制C2C12成肌細胞分化成肌小管。另外，F(xiàn)ormigli等[13]的研究證實：應力活化型離子通道在成肌過程中起重要作用。我們在成功構建SD大鼠乳鼠成肌細胞體外培養(yǎng)－力學刺激模型的基礎上，研究了肌細胞膜上重要的Na+通道蛋白―Na+-K+-ATPase在力學信號轉導中的重要作用及其調控機制。研究發(fā)現(xiàn)：周期性張應力通過內涵體轉運促進成肌細胞膜上Na+-K+-ATPase α亞基蛋白的表達，并改變Na+-K+-ATPase的功能活性。我們的研究證實：Na+-K+-ATPase是成肌細胞感受力學信號并進行跨膜轉導的重要信號分子[14―16]。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated potein kinase,MAPK)級聯(lián)是細胞內重要的信號轉導系統(tǒng)之一。細胞運用這一系統(tǒng)將胞外刺激信號傳遞給胞核,參與細胞生長、發(fā)育、分化和凋亡等一系列生理病理過程。到目前為止,在真核生物細胞中已明確了5條絲裂原活化蛋白激酶通路:細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(Extracellularsignal-regulated protein kinase,ERK)通路、c-jun氨基末端激酶(c-junN-terminal kinase, JNK)通路、p38MAPK通路、ERK3/4和ERK5亞家族，每個亞家族又包含多個亞型。然而，關于何種信號途徑在應力介導的成肌細胞分化中起主要作用，迄今為止還沒有被完全認識。

以上研究說明，力學刺激是維持細胞生存和生長的重要細胞外刺激，它能夠調節(jié)細胞的新陳代謝和基因表達過程。然而，機械力是一個物理信號，力學信號如何被感知進而發(fā)生相應應答，從而調控成肌細胞改建，成為力學信號轉導機制研究的關鍵，也是近年來研究的熱點。

[1] Sanchez-Esteban J,Wang Y,Cicchiello LA,et al.Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2002,282 (3):L448-456.

[2] Ciemerych MA,Archacka K,Grabowska I,et al.Cell cycle regulation during proliferation and differentiation of mammalian muscle precursor cells[J].Results Probl Cell Differ.2011，53:473-527.

[3] Paylor B,Natarajan A,Zhang RH,Nonmyogenic cells in skeletal muscle regeneration[J].Curr Top Dev Biol，2011，96:139-65.

[4] Kyriakis J M,Avruch J.Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation[J].Physiol Rev,2001，81(2):807-869.

[5] MU Jin-ye,CHEN XIao-Guang.The progress of the study on the mitogen-activated protein kinase pathways[J].Chin Bull Life Sci,2002, 14(4):208-211.

[6] Han J,Lee JD,Bibbs L,et al.A MAP kinase targeted by endotoxin andhyperosmolarityinmammaliancells[J].Science,1994，265 (5173):808.

[7] Hale KK,Trollenger D,Rihanek M,et al.Differential expression and activation of p38 mitogen-activated protein kinase alpha,be ta,gamma,and delta in inflammatory cell lineages[J].J Immunol, 1999,162(7):4246.

[8] Yokoyama S,Asahara H.The myogenic transcriptional network[J]. Cell Mol Life Sci.2011 Jun,68(11):1843-1849.

[9] Ingber,D.E.Cellular mechanotransduction:putting all the pieces together again[J].FASEB J,2006,20:811-827.

[10] Zhang SJ,Truskey GA,Kraus WE,et al.Effect of cyclic stretch on beta1D-integrin expression and activation of FAK and RhoA[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,292(6):2057-2069.

[11] Comunale F,Fortier M,Portales-Casamar E,et al.M-cadherin activates Rac1 GTPase through the Rho-GEF trio during myoblast fusion [J].Mol Biol Cell,2007 18(5):1734-1743.

[12] Kumar A,Murphy R,Robinson P,et al.Cyclic mechanical strain inhibits skeletal myogenesis through activation of focal adhesion kinase,Rac-1 GTPase,and NF-kappaB transcription factor[J].FASEB J,2004,18(13):1524-1535.

[13] Formigli L,Meacci E,Sassoli C,et al.Cytoskeleton/stretch-activated ion channel interaction regulates myogenic differentiation of skeletal myoblasts[J].J Cell Physiol,2007,211(2):296-306.

[14] Xiao Yuan,Songjiao Luo,Zhu Lin,et al.Cyclic Stretch Translocates the Alpha-2 Subunit of the Na Pump to Plasma Membrane in Skeletal Muscle Cells in Vitro[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,348（2）：750-757.

[15] Xiao Yuan,Zhu Lin,Songjiao Luo,et al.Effects of Different Mag nitudes of Cyclic Stretch on Na+-K+-ATPase in Skeletal Muscle Cells in Vitro[J].Journal of Cellular Physiology,2007,212（2）：509－518.

[16] Aplinae AE,Howea A,Alahari SK.Signal transdcction and signal modulation by cell adhesion molecules,and selectins[J].Pharmacol Rev,1998;50:197-263.

[17] Baek EB,Kim SJ..Mechanisms of myogenic response:Ca(2+)-dependent and-independent signaling[J].J Smooth Muscle Res,2011; 47(2):55-65.

R329.2+7

A

1008-4118（2012）01-0060-30

10.3969/j.issn.1008-4118.2012.01.34

2012-03-02

郭杰：山東大學口腔醫(yī)院，副主任醫(yī)師。kqji@sdu.edu.cn